Bez tytułu slajdu

Podział aminokwasów

. W zależności od budowy łańcucha bocznego aminokwasu :

- aa z alifatycznym łańcuchem bocznym :

Gly , Ala , Val , Leu , Ile

- aa z łańcuchem bocznym zawierającym grupę hydroksylową :

Ser , Thr , Tyr

- aa z łańcuchem bocznym zawierającym atom siarki :

Cys , Met

- aa z łańcuchem bocznym zawierającym grupy kwaśne lub ich amidy :

Asp , Asn , Gln , Glu

- aa z łańcuchem bocznym zawierającym grupy zasadowe :

Arg , Lys , His

- aa z łańcuchem bocznym zawierającym pierścień aromatyczny :

His , Tyr , Phe , Trp

iminokwas :

Pro

W zależności od właściwości łańcucha bocznego :

- łańcuch boczny niepolarny ( hydrofobowy ):

Ala , Val , Leu , Pro , Ile , Met , Trp , Phe

- łańcuch boczny polarny , aa obojętne :

Gly , Ser , Gln , Asn , Thr , Tyr , Cys

- łańcuch boczny polarny , aa kwaśne ( w pH=7 łańcuch boczny ma ładunek ujemny ) :

aa monoaminodikarboksylowe : Asp , Glu

- łańcuch boczny polarny , aa zasadowe ( w pH=7 łańcuch boczny ma ładunek dodatni ) :

aa diaminomonokarboksylowe : His , Lys , Arg

A) pojawiają się rzadko w białkach :

5 - hydroksylizyna , 4 - hydroksyprolina

kolagen

- tyroksyna ( jodowana tyrozyna )

tyreoglobulina ( białko produkowane przez tarczycę)

- trijodotyronina - hormon tarczycy
- N - metyloarginina , N - acetylolizyna

białka histonowe w chromosomach

- fosfoseryna , fosfotreonina , fosfotyrozyna ( ufosforylowana gr. -OH )

w białkach

komórek regulatorowych i komórek wzrostu.

B) występują w postaci wolnej w tkankach zwierząt i roślin :

glicyna

inaktywuje

      toksyny , łączy  się  z  kwasami  żółciowymi  i  jest  wydalana  do  żółci ,  substrat  do  syntezy
      puryn i  hemu.
      Cystyna  i cysteina

biorą udział w reakcjach utleniania i redukcji

Kwas glutaminowy i asparaginowy

biorą udział w reakcjach transaminacji

( aminotransferaza alaninowa i aminotransferaza glutaminowa)

C)  często  są  produktami  pośrednimi  przemiany  materii . Ważne  intermediaty  cykli
      komórkowych :

- ornityna , cytrulina z Arg ( cykl mocznikowy )

      - homocysteina  -  odmetylowana  Met
      - homoseryna  -  z  Ser
      - β - alanina  -  z  Asp, katabolizmu cytozyny i uracylu
      - tauryna - z  cysteiny

W tym miejscu należy także wspomnieć o bardzo ważnej grupie związków powstających z aa
po ich dekarboksylacji i pełniącą znaczącą rolę w organizmie człowieka :

Aminy biogenne :

Tyr

tyramina - hormon tkankowy , powoduje kurczenie się macicy

Tyr

DOPA

Trp

tryptamina - hormon tkankowy

His

histamina - hormon tkankowy - obniża ciśnienie krwi , powoduje wzrost wydzielania

m in soku żołądkowego. Jest mediatorem procesu zapalnego. Powoduje skurcz mięśni
gładkich , rozszerza naczynia włosowate.
Thr

propanoloamina - składnik Vit. B

Ornityna

putrescyna - składnik rybosomów , produkt metabolizmu bakterii

Lys

kadaweryna - składnik rybosomów , produkt metabolizmu bakterii

Asp

β - alanina - skadnik CoA , anseryny , karnozyny

Cys

cystoamina - składnik CoA

Trp

serotonina - powoduje skurcz mięśni gładkich naczyń krwionośnych , stymuluje OUN.

Niedobór serotoniny prowadzi do depresji
Glu

kwas γ - aminomasłowy ( GABA ) - neuroprzekaźnik w OUN

Ser

etanoloamina - składnik choliny

fosfolipidy

Właściwości chemiczne aminokwasów

1/ Zmiana stanu jonizacji aa w zależności od pH

COOH

COO-

pH = 1

pH = 7

pH = 11

Forma przeważająca jon obojnaczy forma przeważająca
jon dwubiegunowy

Równoczesna obecność w cząsteczkach aa grup - COOH i - NH

sprawia , że  aa  są
związkami  amfoterycznymi , których  charakter  uzależniony  jest  od
stężenia  jonów  H

w roztworze. W roztworze wodnym aa tylko w

znikomej  ilości  ( 0,1% )  występują  jako  cząsteczki  elektrycznie
nienaładowane , w  ogromnej  większości  są  jonami. Jony  w
zależności  od  oddziaływania  środowiska  mogą  mieć  charakter
kwaśny  lub  zasadowy.
W  środowisku  kwaśnym  aa  przyłącza  H

stając się kationem, w

polu elektrycznym wędruje do katody i zachowuje się jak kwas
bo grupa - COOH i NH

mogą oddysocjować proton. W

środowisku zasadowym aa oddysocjowuje H

i staje się anionem ,

polu elektrycznym wędruje do anody i zachowuje się jak zasada
bo grupa
- COO

i NH

może przyjmować proton.

Należy  pamiętać , że  w  przypadku  Asp , Glu , Lys , His , Arg , Tyr , Cys  jonizacji  ulega  również
łańcuch  boczny  aa.
Jon  obojnaczy  jest  amfoteryczny  ponieważ  może  zarówno  przyłączyć  proton  do  grupy - COO

jak i go oddysocjować od grupy NH

Cząsteczka takiego jonu obojnaczego zachowuje się tak jak gdyby nie była naładowana , a więc
nie wędruje w polu elektrycznym gdyż sumaryczny ładunek takiej cząsteczki jest równy zero.

2/.

pH , w którym cząsteczka aa występuje w postaci jonu obojnaczego ( sumaryczny ładunek

cząsteczki = 0 ) nosi nazwę

PUNKTU IZOELEKTRYCZNEGO pI

Każdy  aa  ma  charakterystyczny  dla  siebie  pI  np. :
                                        - alanina =  6,02
                                        - lizyna = 9,7
                                        - arginina = 10,8
                                        - kwas  asparaginowy = 2,98
W  przypadku  aa (

tylko aa

) pI jest równy punktowi izojonowemu tj takiemu pH , przy którym

cząsteczka ma jednakową liczbe protonów uwolnionych z grupy - COOH i protonów
związanych z grupą - NH

3/.

Aa mają właściwości buforowe

4/.

Reakcje jakim ulegają aa :

a) reakcje polimeryzacji :

aa + aa < <- ->> dipeptyd + H

hydroksykwas

!!!

w połowie pochodzi od HNO

a w połowie z wolnych grup -

aminokwasów ,

peptydów czy białek .

Ilość wydzielonego N

jest wprost proporcjonalna do ilości grup - NH

2 .

Reakcja ta jest

wykorzystywana w gazometrycznej metodzie oznaczania ilościowego α - aminokwasów metodą
Van Slyke’a.

Reakcja NINHYDRYNOWA

Aminokwas pod wpływem ninhydryny ulega utlenieniu poprzez α - iminokwas
do aldehydu o 1 atom C uboższego , NH

i CO

W wyniku kondensacji 2 cząsteczek ninhydryny ( utlenionej i zredukowanej ) z NH

powstaje

   związek  o  fioletowym  zabarwieniu , którego  natężenie  jest  wprost  proporcjonalne  do  zawartości
   azotu  α - aminowego  aminokwasów. Jest  to  metoda  spektrofotometryczna , w  której  mierzy  się
   natężenie  barwy  zależnej  od  stężenia  powstałego  kompleksu  ninhydryny  z  NH

przy λ = 540 nm

( α - aminokwasy )

α - iminokwasy z ninhydryną dają produkt

żółty ( Pro , hydroksyPro ).

Reakcja ta jest również podstawą do oznaczenia stężenia aa metodą gazometryczną , w której
oblicza się ilość wydzielonego CO

lub NH

Reakcję ninhydrynową dają również peptydy , białka , sole amonowe , aminocukry i amoniak.
Przy oznaczaniu aa tą metodą należy je wykluczyć.

Reakcje charakterystyczne dla poszczególnych aa :

- Reakcja Adamkiewicza - Hopkinsa - dla tryptofanu ( na pierścień indolowy ).
Z kwasem glioksalowym w środowisku bezwodnym, po podwarstwieniu stężonym H

granicy faz powstaje

fioletowy pierścień

2 cząsteczki Trp kondensują z kwasem glioksalowym związek o

fioletowym zabarwieniu

- Próba Millona - na grupę fenylową ( Tyr )
Tyr + metaliczna Hg rozpuszczona w stężonym HNO

ΔT

W podwyższonej temperaturze

Powstają rtęciowe sole nitrowanej tyrozyny (

czerwone zabarwienie

- Reakcja ksantoproteinowa - pierścień aromatyczny ( Phe , Tyr , Trp )

Phe , Tyr , Trp + stężony HNO

ΔT

Nitrowe pochodne aa o

pomarańczowym zabarwieniu

-  Reakcja  Sakaguchi - dla  Arg.  W  środowisku  10%  roztworu  NaOH + 1%
etanolowy  roztwór
    α - naftolu + NaBrO

(podbromin sodu)

Czerwone zabarwienie kompleksów

( Arg z α-naftolem).

- Reakcja cystynowa - dla cysteiny i cystyny (-SH )
Z ( CH

COO)

Pb w środowisku silnie alkaliczny 30% NaOH po kilkunastu

minutach
      ogrzewania  powstaje  czarny  osad. Ogrzewanie  z  ługiem  daje  hydrolizę  co
powoduje , że  siarka
      z  cystyny  i  cysteiny  ulega  uwolnieniu  w  postaci  jonów  S

, które z Pb

dają

czarny osad PbS.

Metionina nie daje tej reakcji

- dla cysteiny z nitroprusydkiem sodu w środowisku rozcieńczonego NH

•H

powstają

czerwono zabarwione związki.

- dla cysteiny z 1,2 - naftochinolo - 4 - sulfonianem sodowym + podsiarczyn
sodowy - powstają

czerwone związki

( r. Sullimana )

- reakcja Pauly’ego - dla Tyr i His
Tyr lub His

(w roztworze alkalicznym)

+ kwas dibenzenosulfonowy - powstają

czerwone

pochodne

- reakcja Erlicha - dla Trp
Trp + p - dimetyloaminobenzaldehyd + 12M HCl powstaje

niebieskie

zabarwienie

Metody rozdziału mieszaniny aminokwasów :

- chromatografia - czyli rozdział aa między fazę nieruchomą ( stacjonarną ) i

fazę  ruchomą
                                    faza  nieruchoma - ciecz , ciało  stałe
                                    faza  ruchoma  -  ciecz , gaz
  -  chromatografia  cienkowarstwowa  na  adsorbentach  takich  jak : sproszkowana
celuloza ,
                                                                                                                żel
krzemionkowy
  -  chromatografia  bibułowa
  -  chromatografia  kolumnowa  ( kolumna  wypełniona  ziarnami  adsorbenta )
  -  chromatografia  jonowymienna  ( anionowymienna  gdy  ziarna  kolumny są (+) )
                                                          ( kationowymienna  gdy  ziarna  kolumny  są
(- ) )
  -  chromatografia  gazowa
  -  HPLC
  -  elektroforeza

Naturalne peptydy czynne biologicznie :

I  Naturalne  krótkie  peptydy - oligopeptydy
   - karnozyna  ( β - alanylo - L - histydyna ) - występuje  w  mięśniach
   - anseryna  ( β - alanylo - 1 - metylo - L - histydyna )  jak  wyżej

β - alanina wchodzi w skład kwasu pantotenowego ( Vit B

), który

z  kolei  jest
                       składnikiem  CoA

- glutation ( γ - glutamylo - cysteinylo - glicyna ) - jest koenzymem wielu

enzymów  katalizujących
                     procesy  red-ox. Jest  nośnikiem  biorącym  udział  w  transporcie  aa.
  - hormony  tkankowe :

Miejsce biostynezy
plazma krwi

Bradykinina

( 9 nanopeptyd ) - rozkurcz mięśni gładkich i  ciśnienia

Kalidyna

( 10 - reszt aa ) - naczyniorozszerzająco i  ciśnienia

Angiotensyna II

( 8 reszt aa ) - skurcz m gł nacz krwion i  ciśnienia

!! Cykliczne peptydy

Miejsce biosyntezy:
-

podwzgórze

Miejsce gromadzenia i
wydzielania :
-

tylny płat przysadki

Oksytocyna

( 9 r aa) - skurcz mięśni macicy u kobiet w ciąży i

wydzielanie mleka

Wazopresyna

( 9 r aa) -  ciśnienia krwi i  wydalania H

O przez

nerkę - hormon antydiuretyczny

Miejsce biosyntezy
-

podwzgórze

Tyreoliberyna TRF

( 3 r aa ) - uwalnia tyreotropinę z

przedniego płata przysadki

Gonadoliberyna LHRF

FSHRF

( 10 r aa ) - pobudza syntezę i

wydzielanie LH i FSH

Somatoliberyna GHRF

( 10 r aa ) - pobudza syntezę i wydzielanie

Somatotropiny GH

Niektóre antybiotyki :

Gramicydyna S

- ( 10 r aa )

Aktynomycyna

Walinomycyna

( 6 r aa + 6 hydroksykwasów )

Penicylina

( 2 r aa - Val i Cys + reszta kwasowa )

II Naturalne długie peptydy - polipeptydy

- Miejsce biosyntezy -

przedni płat przysadki :

ACTH

- adrenokortykotropina ( 39 r aa ) - pobudza nadnercza do uwalniania glikokortykoidów

TSH

- tyreotropina ( α - 96 r aa i β - 113 r aa ) - pobudza tarczycę do uwalniania trijodotyroniny i

tyroksyny

FSH

- hormon folikulotropowy , folitropina (α , β ) - odpowiada za tworzenie i wydzielanie

                 steroidów  płciowych.  U  kobiet  jest  odpowiedzialny  za  dojrzewanie  pęcherzyków
                 Graffa. U  mężczyzn  wpływa  na  cewkę  nasienną  w  jądrach.

- hormon luteinizujący , lutropina (α , β ) - odpowiada za tworzenie i wydzielanie steroidów

płciowych. U kobiet wywołuje owulację i tworzenie ciałka żółtego w jajnikach.
U mężczyzn - pobudza wydzielanie komórek śródmiąższowych ( Leydiga ) w jądrach.

- somatotropina ( 190 aa ) hormon wzrostu ( BIAŁKO !! )

PRL

- prolaktyna (198 aa ) - pobudza wydzielanie mleka ( BIAŁKO !! )

Miejsce biosyntezy -

środkowy płat przysadki

MSH

- melanotropina ( 13 i 18 r aa ) - reguluje metabolizm pigmentu

Miejsce biosyntezy -

podwzgórze :

- Wcześniej wymienione liberyny - krótkie peptydy
- CRF -

kortykoliberyna ( 41 aa ) - pobudza syntezę i wydzielanie ACTH

- GH-IH -

somatostatyna (14 aa )

- PRL-IH -

prolaktostatyna ( dopamina)

Miejsce biosyntezy -

tarczyca :

- Kalcytonina -

( 32 aa ) -  poziom Ca

w surowicy, hamuje resorpcję Ca

z kości i

kanalików nerkowych.

Miejsce biosyntezy -

przytarczyce :

- PTH -

( 84 r aa ) -  Ca

w surowicy (  resorpcji z kości ,  wchłaniania w jelitach ,

 wydalania z moczem )

Miejsce biosyntezy -

trzustka :

- komórki wyspowe kwasochłonne  -

Glukagon

- ( 29 aa ) powoduje  glukozy we krwi

 glikogenolizy ,  lipolizy

- komórki wyspowe zasadochłonne -

Insulina

- ( 51 aa ) powoduje  glukozy we krwi

 syntezy kwasów tłuszczowych i TG

Miejsce biosyntezy -

śluzówka żołądka :

- Gastryna

( 17 aa ) - pobudza wydzielanie HCl

Miejsce biosyntezy-

śluzówka jelit :

- Sekretyna

( 27 aa ) - pobudza syntezę i wydzielanie

enzymów trawiennych.
Trucizny :

Ammanityna i Falloidyna

- toksyny muchomora sromotnikowego.

B I A Ł K A

- To związki organiczne o dużej masie cząsteczkowej , zbudowane głównie z

aa połączonych

wiązaniami peptydowymi.

- Białka zbudowane są z 1 lub kilku łańcuchów peptydowych :

- 1 łańcuch



białko monomeryczne ( cytochrom C , mioglobina , rybonukleaza )

- kilka łańcuchów



białko polimeryczne:

- homopolimeryczne ( takie same łańcuchy ) np.

heksokinaza ( α

)

- heteropolimeryczne ( różne łańcuchy ) np. Hb ( α

)

--- Podział białek ---

1/. Na podstawie kształtu cząsteczki białka (stosunek osiowy - czyli stosunek

długości do szerokości)

białka globularne

- stosunek osiowy < 10 ( 3 - 4 ), łańcuchy polipeptydowe

ściśle pofałdowane i

zwinięte np. albuminy i globuliny osocza , większość enzymów

białka włókienkowe ( fibrylarne )

- stosunek osiowy > 10 , łańcuchy

polipeptydowe zwinięte

śrubowo lub w helisy , połączone krzyżowo wiązaniami kowalencyjnymi lub

wodorowymi np.

- β-keratyna

- α-keratyna

- kolagen

2/.

Klasyfikacja białek na podstawie ich rozpuszczalności

- Albuminy - R w H

O i roztworach soli

- Globuliny - słabo R w H

O ale dobrze w roztworach soli

- Prolaminy - R w 70 - 80% etanolu. NR w H

O i etanolu absolutnym. Bogate w Arg

- Histony - R w roztworach soli i kwasów nieorganicznych

- Skleroproteiny - NR w H

O ani w roztworach soli. Bogate w Gly , Ala , Pro

3/.

Klasyfikacja białek na podstawie budowy chemicznej

- białka proste ( homoproteiny ) składają się niemal wyłącznie z aa

- białka złożone (heteroproteiny) zawierają integralną część niebiałkową -

grupę prostetyczną

mocniej lub słabiej związaną z częścią białkową np. :

- glikoproteiny - fibronektyna , IgG

- fosfoproteiny - ufosforylowana Ser , Thr , Tyr - kazeina , fosforylaza glikogenowa

- lipoproteiny - LDL , HDL

- nukleoproteiny - chromosom , rybosom

- metaloproteiny - ferrytyna ( Fe

) , transferyna ( Fe

), dehydrogenaza alkoholowa ( Zn

oksydaza cytochromowa ( Cu i Fe )

- chromoproteiny ( hem ) - Hb , cytochrom C , katalaza , mioglobina

- flawoproteiny ( FAD , FMN ) - dehydrogenaza bursztynianowa

4/.

Podział ze względu na rolę białka w organizmie

5/.

Podział ze względu na pochodzenie białka :

roślinne , zwierzęce , bakteryjne , wirusowe

6/. Podział białek ze względu na wartość odżywczą :

- białko pełnowartościowe - zawiera wszystkie aa niezbędne

- białko niepełnowartościowe - brak przynajmniej jednego aa niezbędnego

W budowie białka wyróżnia się 4 zasadnicze poziomy organizacji łańcucha polipeptydowego:

struktura I rzędowa



sekwencja aa w łańcuchu polipeptydowym.

- struktura II rzędowa



przestrzenne ułożenie reszt aa sąsiadujących ze sobą w sekwencji

liniowej ( wiązania wodorowe , jonowe , disiarczkowe , oddziaływania

hydrofobowe , wiązania van der Walsa , estrowe , O , N - glikozydowe).

- struktura III rzędowa



określa powiązania przestrzenne i wzajemne ułożenie reszt aa

oddalonych od siebie w sekwencji liniowej oraz lokalizację mostków

disiarczkowych. Określa przestrzenne ułożenie łancucha polipeptydowego.

- struktura IV rzędowa



w białkach zbudowanych z więcej niż jednego łańcucha

polipeptydowego. Określa wzajemne ułożenie przestrzenne podjednostek

i rodzaj ich kontaktu ( Hb , kolagen , wirus polio , Rynowirus 14 ).

Rola białek , funkcje :

- enzymatyczna -

prawie wszystkie enzymy są białkami , zwiększają szybkość reakcji o około

1 mln razy . Istnieje kilka tysięcy enzymów, z których każdy katalizuje

swoistą dla siebie reakcję chemiczną np.: trypsyna , pepsyna , rybonukleaza ,

dehydrogenaza alkoholowa , katalaza , fosfofruktokinaza.

- budulcowa :

α - keratyna - włosy , rogi , paznokcie

kolagen

elastyna - białko tkanki łącznej , odpowiedzialnym za zdolność tkanek do

rozciągania i powrotu do uprzedniego kształtu. Nie jest tak

rozpowszechniona jak kolagen , ale występujje w dużych ilościach w

tkankach , które wymagają takich właściwości fizycznych , a więc np.:

w płucach , dużych tętnicach i niektórych więzadłach sprężystych

białka błonowe - białka strukturalne

- magazynowa :

ceruloplazmina - białko magazynujące Cu

ferrytyna - białko magazynujące Fe

mioglobina - magazynuje O

w mięśniach

- transportowa :

Hb - transport O

we krwi

transferyna - transport Fe

albumina - transport np. leków

- regulacyjna :

hormony : peptydowe (omówione wcześniej), białkowe np. GH , PRL (omów wcześniej)

białka represorowe - hamują transkrypcję genów

- ochronna :

immunoglobuliny - układ odpornościowy

trombina , fibrynogen - ochrona przed utratą krwi

- ruch :

aktyna , miozyna - mięśnie

tubulina - białko mikrotubul biorące udział w podziałach komórkowych

- rola buforowa :

we krwi - albuminy

- wytwarzanie i przekazywanie impulsów nerwowych :

białka receptorowe - rodopsyna ( białko fotoreceptorowe występujące w siatkówce oka ).

*** Właściwości białek ***

mają charakter związków wielkocząsteczkowych, co powoduje , że białka nie dializują , a

roztwory białek wykazują właściwości - cechy koloidów

wywierają ciśnienie koloido - osmotyczne

mają zdolność wiązania jonów

wędrują w polu elektrycznym dzięki ładunkowi elektrycznemu cząsteczki. Szybkość

poruszania się w polu elektrycznym zależy od wielkości ładunku elektrycznego , oraz od

rozmiarów i kształtu cząsteczki

większość białek dobrze rozpuszcza się w H

O , niektóre w trozcieńczonych roztworach

soli , kwasów i zasad. O rozpuszczalności decyduje przede wszystkim ich zdolność do

hydratacji , budowa chemiczna , obecność soli w środowisku i pH środowiska

białka ulegają wysalaniu pod wpływem silnych elektrolitów np. soli Stężenie soli potrzebne

do wysolenia zależy od właściwości białka i pH środowiska. Wysalacze : (NH

)

, MgSO

aceton , etanol ( ale działając krótko ). Wysalanie jest procesem odwracalnym bo nie powoduje

denaturacji białka.

- Wsalanie jest procesem odwrotnym do wysalania , którego dokonuje się przez stopniowe

rozcieńczanie roztworu białek.

- Białka ulegają denaturacji .

Zniszczeniu ulega IV , III , lub II rzędowa struktura białka , I rzędowa struktura pozostaje

niezmieniona - a więc zmianie ulega konformacja łańcucha polipeptydowego. Białko traci

swoje właściwości. Rozrywane są wiązania wodorowe , jonowe , hydrofobowe , disiarczkowe ,

van der Walsa.

DENATURACJĘ POWODUJĄ :

Czynniki fizyczne : ogrzewanie , wysalanie , ultradźwięki , promieniowanie , wstrząsanie

wodnych roztworów białek w atmosferze powietrza.

Czynniki chemiczne : kwasy , zasady , jony metali ciężkich , chlorowodorek guanidyny ,

mocznik , detergenty , fenol , chloroform , rozpuszczalniki mieszające się

wodą ( etanol , aceton )

- Skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego w lewo , ponieważ zbudowane są z L-aa.

- Roztwory białek cechuje duży współczynnik załamania światła , który wzrasta liniowo w

miarę wzrostu stężenia białka w roztworze , co wykorzystuje się do ilościowego oznaczania

białka metodą referencyjną

- Z powodu obecności wiązań peptydowych białka pochłaniają światło nadfioletowe z max

absorbancji przy λ = 230 nm, a z powodu obecności Tyr i Trp przy max λ = 280 nm

- Masa cząsteczkowa białek waha się od 10.000 do wielokrotności miliona.

- Białka są związkami amfoterycznymi.

- Każde białko ma charakterystyczny dla siebie punkt izoelektryczny pI np.:

- pepsyna 1.0

- kazeina 4.7

- mioglobina 7.0

- trypsyna 10. 5

W punkcie izoelektrycznym rozpuszczalność białka jest najmniejsza i najłatwiej jest wtedy

takie białko wytrącić z roztworu bądź wykrystalizować.

W punkcie izoelektrycznym białko :

- wykazuje najmniejsze ciśnienie osmotyczne

- ma najmniejszą lepkość

- najsłabiej pęcznieje

- nie reaguje z anionami ani z kationami

- wykazuje najmniejszą ruchliwość elektroforetyczną

- Białka mają właściwości buforowe w odpowiednim przedziale pH

Reakcje chemiczne , którym ulegają białka

Reakcja ninhydrynowa

Reakcja ninhydrynowa -

aa , peptydy , białka , sole amonowe ,

aminocukry , amoniak

- Reakcja z HNO

- Reakcja biuretowa ( Piotrowskiego ) - peptydy i białka.

Jest to

reakcja na wiązania

peptydowe.

W środowisku alkalicznym 2 wiązania peptydowe tworzą

kompleks z jonami

dając zabarwienie fioletowo - niebieskie. Reakcji tej ulegają więc

tylko tripeptydy ,

tetra - , penta - ....peptydy. Dipeptydy powyższej reakcji nie ulegają.

Reakcja służy do

oznaczeń ilościowych i jakościowych.

- Metoda Lowry’ego - do ilościowego oznaczania peptydów i białek.

Metoda wykorzystuje

czułą reakcję wiązań peptydowych i tyrozyny z odczynnikiem

wolframowo - molibdenowo -

fosforowym ( Folina - Ciocalteu ). Jest to kombinacja reakcji

biuretowej oraz reakcji

między resztami tyrozyny a odczynnikiem Folina , w której powstają

barwne , niebieskie

produkty. Metoda pozwala na oznaczenie białka w stężeniu 1μg / ml.

Jest zatem ok. 100

razy dokładniejsza i czulsza niż biuretowa.

- Metoda oznaczania zawartości białka za pomocą pomiaru

absorbancji w nadfiolecie -

peptydy i białka. Większość białek ze względu na zawartość reszt

Tyr i Trp wykazuje

max absorbancji przy λ = 280 nm. Związki , które mogą wpływać na

absorbancję to :

kwasy nukleinowe ( wykazujące max absorbancji przy λ = 260 nm )

oraz puryny ,

pirymidyny i fenole.

- Metoda Bradforda - peptydy i białka - metoda służy do oznaczeń

ilościowych

Z błękitem brylantowym Coomassie’go G-250 w środowisku

kwaśnym białko wiąże się

za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych Arg , w mniejszym

stopniu His , Lys , Tyr ,

Trp , Phe. W wyniku reakcji powstaje brunatne zabarwienie wprost

proporcjonalne do

zawartości białka w roztworze.

- Metoda Kjeldahla - oznaczanie zawartości azotu białkowego -

oznaczanie ilościowe.

Azot białka oznacza się po rozkładzie białka do NH

. Białko gotuje

się ze stężonym

+ katalizator



następuje zniszczenie białka i powstaje

(HN

)

Następnie

dodaje się nadmiar alkaliów , które powodują uwolnienie NH

, który

wyłapuje się w

płuczce z H

. Następnie oznaczenie prowadzi się przez

miareczkowanie.

- Hydroliza wiązania peptydowego.

A) hydroliza kwaśna

6 - 12N HCl lub 4 - 7N H

w temperaturze 110



C przez 24 ,

48 i 72 godziny

Używamy 5 - 10 razy więcej kwasu niż białka . Nie wolno używać

HNO

gdyż powoduje

utlenienie bądź nitrowanie pierścieni .

Wady :

niszczy : - Trp

- Powoli aa z grupą -OH : Ser , Thr ( ale mając

stężenia tych aa po

czasie 24 , 48 ,72 h można ekstrapolować

stężenie wyjściowe )

- Gln , Asn w środowisku kwaśnym są nietrwałe



Glu , Asp + NH

Na podstawie uwolnionego NH

oznaczamy

sumę Gln + Asn i np.

chromatograficznie sumę Asp + Asn oraz Glu +

Gln

B/. Hydroliza zasadowa - w 2M NaOH - rzadko stosowana bo powoduje

racemizację i straty

Ser , Thr , Arg , Cys .

Trp - nie ulega zniszczeniu , stąd metodę tę można stosować do

odzysku Trp

C/. Hydroliza enzymatyczna - najlepsza !

Endo- i egzopeptydazy

Karboksy- i aminopeptydazy

Schemat uzyskiwania czystej frakcji białek z materiału

biologicznego

1. Ekstrakcję białka z materiału biologicznego rozpoczynamy od

homogenizacji tkanki w

zimnym ( ok. 4ºC ) buforze. Do buforu dodajemy inhibitory proteaz

aby zapobiec proteolizie .

2. Wytrząsanie z H



białka rozpuszczalne w H

O przechodzą do

roztworu

3. Ekstrakcja białka do 1:1 etanol : chloroform

4. Wysalanie przy odpowiednim stężeniu soli ( wypada kilka białek )

5. Wsalanie

6. Wytrącanie w pJ ( kilka białek ). Pozbywamy się przy okazji znacznej

ilości białek

balastowych.

7. Adsorbcja na żelu fosforanowo - wapniowym

8. Elucja z żelu

9. Wysalanie

10. Wsalanie

11. Oczyszczanie końcowe i analiza .

Na każdym etapie oczyszczania należy kontrolować obecność

badanego białka

Uzyskiwanie frakcji białkowych

1. Wirowanie różnicowe

- f. Jąder komórkowych i nie rozerwane fragmenty komórkowe - wirowanie 600 G 3 minuty

- f. Mitochondriów , chloroplastów , lizosomów i peroksysomów - wirowanie 6000 G 8 min.

- f. Mikrosomalna : błony komórkowe , fragmenty aparatu Golgiego i ER

wirowanie - 40 000 G 30 min.

- f. Podjednostek rybosomów - wirowanie 100 000 G 90 min. W roztworze pozostają białka

cytoplazmatyczne.

- f. Białek cytoplazmatycznych - wirowanie



100 000 G

2. Wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy ( lizosomy



mitochondria



peroksysomy )

Rozdział mieszaniny białek

- biorąc pod uwagę wielkość ( rozmiar ) cząsteczek :

•

Elektroforeza żelowa ( na żelu poliakryloamidowym ) w obecności SDS - rozdział białek

odbywa się na podstawie masy cząsteczkowej białka .

•

Chromatografia żelowa - filtracja żelowa ( sączenie molekularne ). Fazą nieruchomą jest

żel polisacharydowy , który dzaiła jak sito molekularne . Jego cząstki zawierają wypełnione

wodą puste przestrzenie - kanaliki - do których przenikają małe i średnie cząsteczki . Duże

cząsteczki pozostają na zewnątrz. Odpowiedni rozpuszczalnik wymywa je.

•

Ultrafiltracja

•

Ultrawirowanie - wirowanie w gradiencie gęstości.

W tym celu nawarstwia się roztwory sacharozy o różnej gęstości. Podczas wirowania

białka wędrują tak długo aż własna gęstość białka zrówna się z gęstością rozpuszczalnika.

Po odwirowaniu rozdzielamy warstwy przez kolejne zlewanie każdej z nich z osobna.

- biorąc pod uwagę ładunek elektryczny :

•

Chromatografia jonowymienna

•

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym

Przy odpowiednim pH , które ustala się przez zastosowanie buforu , różne białka wędrują

w polu elektrycznym zgodnie ze swoim ładunkiem elektrycznym. Cząsteczki białka o

wypadkowym cząstkowym ładunku ujemnym wędrują w kierunku Anody, białka

posiadające ładunek dodatni - w kierunku Katody. Prędkość wędrówki zależy od sumy

ładunków , wielkości i kształtu cząsteczki . ( Elektroforeza dyskowa , Immunoelektroforeza )

•

Elektroforeza w gradiencie pH - ogniskowanie izoelektryczne

Białko będzie wędrowalo do momentu osiągnięcia pozycji , w której pH żelu

zrówna się z pH białka .

•

HPLC

- biorąc pod uwagę wielkość cząsteczki i ładunek elektryczny

•

Rozdzielanie na podstawie rozpuszczalności .

Polega na wysalaniu z roztworu wodnego solami obojętnymi np.: (NH

)

lub MgSO

Do roztworu białek dodaje się wzrastającą ilość soli każdorazowo odwirowując wytrącone

białko. Przez zmianę pH metodę można udoskonalić. Metoda ta stosowana jest tylko do

oczyszczania wstępnego .

Po wyizolowaniu białka w czystej postaci wyżej wymienionymi metodami białko należy

scharakteryzować pod względem chemicznym :

- przez wyznaczenie punktu izoelektrycznego

- przez wyznaczenie względnej masy cząsteczkowej

- przez analityczne oznaczenie całkowitego stężenia białka

- charakterystyka immunologiczna

Metody wyznaczania względnej masy cząsteczkowej :

•

ultrawirowanie przez wyznaczenie stałej sedymentacji Svedberga

•

na podstawie składu białka ( oznaczamy ilość O , C , N , S



masa białka )

•

na podstawie ciśnienia osmotycznego jakie białko wywiera na błonę półprzepuszczalną

w ściśle określonym pH i stężeniu białka w roztworze.

•

na podstawie efektu Tyndala ( rozpraszania światła )

•

chromatografia na sitach molekularnych

•

Elektroforeza żelowa SDS

•

Metoda wirowania w różnych gradientach stężeń

60 - 20% roztwór sacharozy

6M roztwór chlorku cezu sam tworzy gradient

Są to metody porównawcze naszego białka z białkiem stanowiącym wzorzec standardowy.

Określenie struktury I rzędowej białka

1. Jeśli białko jest heteropolimeryczne tzn zawiera wiecej niż jeden łańcuch polipeptydowy

to łańcuchy należy rozdzielić i oczyścić .

Rozrywanie wiązań :

- wodorowe - 8M mocznik

6M chlorowodorek guanidyny

- diS - utlenianie kwasem nadmrówkowym do SO

- redukcja za pomocą β - merkaptoetanolu do -SH a następnie należy

podziałać kwasem jodooctowym lub akrylonitrylem aby zablokować

grupę -SH i zapobiec powstawaniu nowych wiązań diS

- hydrofobowe - detergenty

- jonowe - kwasy , zasady

Rozdział i oczyszczanie - podobnie jak białka

2. Określenie reszty aa na N i C - końcu każdego z rozdzielonych łańcuchów .

N - koniec

A) z odczynnikiem Sangera ( 1 - fluoro - 2,4 - dinitrobenzen ) FDNB

w środowisku alkalicznym



HF + dinitrofenyl - peptyd



kwaśna hydroliza



rozrywa

łańcuch polipeptydowy



+ dinitrofenyl - aa ( N - końcowy aa połączony przez

grupę -NH

z dinitrobenzenem ). Jest to żółta pochodna dinitrofenylowa nie ulegająca

rozkładowi w czasie hydrolizy.

Z odczynnikiem może również kondensować grupa -SH Cysteiny , -OH Tyrozyny ,

dodatkowe grupy -NH

aa zasadowych , pierścień imidazolowy Histydyny.

Dinitrofenylowe pochodne można rozdzielić chromatograficznie ( bibułowa ,

cienkowarstwowa , kolumnowa )

B) z chlorkiem dansylu ( HCl 1-dimetyloaminonaftyleno-5-sulfonylu )



HCl + dansyl - peptyd



kwaśna hydroliza



dansyl - aa + aa

Reakcja ta jest ok. 100 razy czulsza niż z odczynnikiem Sangera

C) DEGRADACJA EDMANA z fenyloizotiocyjanianem ( odczynnikiem Edmana )

środowisko alkaliczne pH=8 - 9



fenylotiokarbamoilowe pochodne



słaby kwas

trifluorooctowy



fenylotiohydantoinowa pochodna z N - końca + peptyd

Analiza ciągła np. przez zastosowanie metod chromatograficznych.

C - koniec

A) Hydrazynoliza - reakcja Akabori

polipeptyd + bezwodna hydrazyna NH

-NH

w 100°C 5 godzin



hydrazydy + wolny

C-terminalny aa. Identyfikacja chromatograficzna. Potwierdzenie - reakcja barwna.

B) Redukcja C - końcowego aa za pomocą LiAlH

( wodoroglinian litu )

wolna grupa -COOH



redukcja do -CH

-OH ( alkoholu )



kwaśna hydroliza



aminoalkohol z C-końcowego aa ( oznaczany chromatograficznie ) + aa

C) Karboksypeptydaza - odcina C - końcowy aa ( z wolną grupą -COOH )

- karboksypeptydaza A - odcina C - końcowy aa oprócz Pro , Arg , Lys

- karboksypeptydaza B - efektywna gdy C - końcowym aa jest Arg lub Lys

Fragmentacja łańcucha polipeptydowego

A) Enzymatyczna

- Trypsyna - tnie wiązania peptydowe po karboksylowej stronie reszt Arg i Lys

- Chymotrypsyna - po stronie karboksylowej reszt aa aromatycznych ( Phe , Tyr , Trp )

- Klostrypaina - po stronie karboksylowej reszt Arg

- Proteaza ze

Staphylococcus

- po karboksylowej stronie reszt asparaginianowych i

glutaminianowych ( glutaminowych tylko w pewnych warunkach : w buforze

wodorowęglanowym lub octanowym ) . Enzym bardzo wybiórczy

B) Nieenzymatyczna fragmentacja

- Bromocyjan ( CNBr ) - po karboksylowej stronie reszt metioninowych

- O - jodobenzen - po karboksylowej stronie reszt tryptofanowych

- Hydroksylamina - wiązania Asn-Gly w pH=9,0 Asp-Pro w pH=2,5 w 40°C

- 2-Nitro-5-tiocyjanobenzen -

po aminowej stronie reszt Cysteiny

Rozdzielenie fragmentów np. chromatograficznie i określenie ich sekwencji :

- degradacja Edmana

- spektroskopia masowa (



dokładność i czułość )

Określenie struktury przestrzennej białka :

- spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego - NMR

- krystalografia rtg

- spektroskopia elektronowa

- rentgenografia krystaliczna i dyfrakcyjna

Document Outline