Insulina

Cukrzyca

Cukrzyca (

diabetes mellitus

) jest przewlekłą

chorobą przemiany materii spowodowaną

brakiem lub nieprawidłowym działaniem

hormonu - insuliny. Wraz z zaburzeniem

gospodarki cukrowej organizmu zaburzona

zostaje również gospodarka tłuszczowa,

białkowa i wodno-elektrolitowa.

Światowa Organizacja Zdrowia szacuje, że

w 1985 roku było na świecie 30 mln ludzi

chorujących na cukrzycę, 10 lat później

135 mln, a w roku 2000 - 171 mln. Przewiduje

się, że w roku 2030 będzie około 366 mln ludzi

chorych na cukrzycę

Objawy cukrzycy:



zmęczenie,



osłabienie,



wielomocz (czyli częste oddawanie dużej ilości

moczu),



nadmierne pragnienie,



zwiększony apetyt,



chudnięcie.

Podstawowe znaczenie dla rozpoznania

cukrzycy mają badania biochemiczne krwi i

oznaczenie zawartości cukru we krwi oraz w

moczu (tzw. glikozurii, czyli cukromoczu).

Prawidłowe stężenie glukozy we krwi



glikemia na czczo: 3,4-5,5 mmol/l (60-99 mg/dl)



glikemia przygodna: <11,1 mmol/l (<200

mg/dl) - powyżej tego poziomu u chorych z

objawami rozpoznaje się już

cukrzycę

Typy cukrzycy:



Typ I

: występuje u ludzi młodych jest spowodowana

zniszczeniem lub niewydolnością komórek trzustki,

odpowiedzialnych za produkcję i wydzielanie insuliny. Ten

rodzaj cukrzycy nazywany jest cukrzycą insulinozależną



Typ II

: występuje u ludzi starszych, na ogół otyłych i z

nadciśnieniem tętniczym, cukrzycę wywołuje oporność na

działanie insuliny. Wymaga ciągłego przyjmowania

odpowiednich leków doustnych. Często, z czasem,

potrzebne jest także przejście na zastrzyki z insuliną



Wtórna

: jest spowodowana rozregulowaniem

metabolizmu organizmu przez inne zaburzenia lub

zespoły chorobowe



Ciążowa

: spowodowana zaburzeniem gospodarki

hormonalnej organizmu podczas ciąży. Zazwyczaj

całkowicie ustępuje po porodzie, ale zwiększa ryzyko

zachorowania na cukrzycę typu 2 w przyszłości



Cukrzyca typu pierwszego (insulinozależna):



spowodowana jest genetycznym, wrodzonym

uszkodzeniem komórek beta w trzustce

produkujących insulinę.



objawy wynikają z niedoboru lub całkowitego

braku endogennej insuliny,



objawia się w dzieciństwie lub okresie

młodzieńczym,



jest związana z dożywotnią koniecznością

przyjmowania insuliny.



Cukrzyca typu drugiego (insulinoniezależna):



występuje zazwyczaj u ludzi po 40 roku

życia,



jest związana ze zwyczajami żywieniowymi

i otyłością,



początek leczenia - leki doustnych, a po

pewnym czasie progresja choroby zmusza do

stosowania insuliny.

Hormony

są to chemiczne

substancje

sygnałowe,

syntetyzowane

przez wyspecjalizowane

komórki

gruczołów

dokrewnych.

Są one

wydzielane do

krwi

i z nią

transportowane do

narządów docelowych,

których regulują procesy

fizjologiczne i biochemiczne.

Działanie hormonów:



endokrynne,



parakrynne,



autokrynne.



Insulina

która wytwarzana jest w komórkach B

trzustki, ma działanie:



parakrynne - ha mowanie wytwarzania i

uwalniania

glukagonu

z sąsiednich komórek A

wysp trzustkowych,



endokrynne - w regulacji metabolizmu glukozy i

lipidów.

Hormony

Lipofilowe

Hydrofilowe

Hormony

Steroidowe

(Progesteron ,

Testosteron,

Kortyzol,

Aldosteron,

Kalcytriol)

Jodotyroniny

(Tyroksyna)

Kwas

retinowy

Pochodne

aminokwasów

(Histamina,

Serotonina,

Melatoni na,

Aminy katecholowe,

tj. DOPA,

dopamina,

noradrenalina,

adrenalina)

Peptydy,

białka złożone

z aminokwasów

(Tyreoliberyna,

Tyreotropina,

Insulina,

Glukagon)

Insulina może

tworzyć dimery

i heksamery.

Są one jednak

dużo wolniej

wchłaniane w

organiźmie.

Przeprowadza się

modyfikaję polegającą

na zmianie kolejności

ostatnich

aminokwasów co

zapobiega tworzenia

złożonych struktur

Insulina może

tworzyć dimery

i heksamery.

Są one jednak

dużo wolniej

wchłaniane w

organiźmie.

Przeprowadza się

modyfikaję polegającą

na zmianie kolejności

ostatnich

aminokwasów co

zapobiega tworzenia

złożonych struktur

WYDZIELANIE

INSULINY

Insulina jest wytwarzana w

organizmie w odpowiedzi na

zmianę stężenia glukozy we

krwi. Transportery glukozy

GLUT2 pozwalają wniknąć

cząsteczce glukozy do

komórek beta. Wewnątrz

zachodzi fosforylacja glukozy,

która w następnych etapach

jest metabolizowana do ATP.

Zwiększony stosunek

ATP:ADP powoduje

zamknięcie kanałów

potasowych w wyniku czego

następuje wzrost stężenia

jonów K+ a dalej polaryzację

błony. Efektem tego jest

otwarcie kanałów wapniowych

i wpłynięcie jonów Ca+ do

środka komórki. W wyniku

tego insulina jest wydzielana

do krwi.

DZIAŁANIE

INSULINY

Insulina krąży we

krwi gdy poziom

glukozy wzrasta.

Przyłącza się ona do

receptorów w

komórce. W wyniku

tego wewnątrz

komórki

przekazywany jest

sygnał o

wychwytywaniu

glukozy z krwi. W

komórce istnieją

specjalne

transportery

glukozy typu GLUT4

przystosowane do

wyłapywania

glukozy z obiegu.

Rola insuliny polega na:



wykorzystywaniu cukrów i

tłuszczów jako materiału

energetycznego dla komórek;



magazynowaniu nadmiernej

ilości cukrów w postaci zapasów;



wytwarzaniu białek z substancji

znajdujących się w pożywieniu.

Rola insuliny



Pomaga glukozie wniknąć do

komórek



Stymuluje magazynowanie glukozy

w wątrobie



Pobudza wytwarzanie tłuszczu z

nadwyżki węglowodanów



Pobudza wytwarzanie związków

białka

Preparaty Insulinowe



insulina zwierzęca



pozyskiwana z trzustek zwierzęcych (dawcami są świnie,

krowy i psy),



skomplikowana technologia produkcji (problemy z

oczyszczeniem),



wieprzowa insulina ma budowę bardzo zbliżoną do ludzkiej

(różnica dotyczy tylko jednego aminokwasu), mimo to

immunizuje i alergizuje pacjentów powodując liczne

powikłania terapii



insulina humanizowana



insulina wieprzowa, w której metodą chemiczną wymienia się

jeden aminokwas;



insulina ludzka



produkt uzyskany dzięki inżynierii genetycznej,



Wytwarzana przez bakterie lub grzyby, do których

wprowadzono ludzki gen kodujący insulinę,



uzyskany produkt jest identyczny z insuliną wytwarzaną

przez trzustkę człowieka;



analog insuliny ludzkiej



insulina ludzka, w której wymieniono jeden lub parę

aminokwasów, dzięki czemu uzyskuje się szczególne

właściwości produktu

„

Produkcja insuliny ludzkiej

jest jednym z najbardziej

skomplikowanych procesów

biochemicznych. Technolodzy

mówią, że jeśli ktoś umie

zrobić insulinę, to już resztę

wykona za niego nawet stróż

w wolnym czasie”

Gazeta Wyborcza

Metody rekombinacji



Przy użyciu

E. coli

z wstawką

zawierającą gen kodujący proinsulinę



Przy użyciu

E. coli

z wstawką

kodującą poszczególne łańcuchy

insuliny



Przy użyciu

Saccharomyces

cerevisiae

zawierających gen

proinsuliny

Rekombinacja -

Szczegóły



Szczep

E. Coli

JM101



Plazmid

pKK233-3



Wstawka genu ludzkiej proinsuliny z

bibliotek cDNA



Enzymy restrykcyjne



Eco



Hin

dIII



Transformacja bakterii na podłożu LB-

agar z dodatkiem ampicyliny 100 [

g/ml]

PRZECHOWYWANIE

SZCZEPÓW



Bakterie są przechowywane w postaci

zamrożonej (-70

C do -80

C )

, a do

kolejnych szarż procesu ożywiane

i poddane rozmnażaniu przez

klonowanie



Stabilność cech nabytych przez

genetyczne zmodyfikowanie są

kontrolowane poprzez umieszczenie

szczepów w roztworze z niewielką

ilością ampicyliny i tetracykliny

Technologie produkcji

insuliny



Produkcja gotowej insuliny produkowanej

w procesie sekrecji plazmidowej

E. Coli



Produkcja proinsuliny i przekształcanie w

insulinę na drodze:



Chemicznej



Enzymatycznej



Produkcja osobno łańcuchów A i B

insuliny z osobnych wstawek, wydzielenie

i finalne łączenie enzymatyczne

(proces

najnowszy)

Fermentacja



Zrekombinowane uprzednio bakterie

E. Coli

namnażane są w bioreaktorze



Bioreaktor typu okresowego, lub

semi-okresowego



Warunki procesu muszą być ściśle

przestrzegane ponieważ procesem

konkurencyjnym w stosunku do

sekrecji rekombinowanego białka

przez

E. Coli

jest produkcja octanu

WARUNKI BIOSYNTEZY



Szczep E. Coli DH5 z Clontech-BD Biosciences, PaIo Alto,

California, USA



Bioreaktor (z urządzeniem napowietrzającym i

mieszadłem)



pH 6.8



temp 37



pożywka SOC (kompletna, bogata pożywka do efektywnej

hodowli bakterii

E. coli

poddanych transformacji

plazmidowej ; skład:

2% (w/o) trypton

0,5% (w/o) ekstrakt drożdżowy

0,05% (w/o) NaCl

2,5 mM KCl

20 mM sterylnej glukozy

w wodzie bidestylowanej

Zalety:

-prostota prowadzenia operacji,

-łatwość utrzymania warunków jałowych,

-odnawialność inokulum zapobiega
degeneracji szczepu.

Wady:
-niska produkcyjność procesu,
-brak możliwości regulacji stężenia
substratu.

hodowla na podłożu ciekłym – HPC,

okresowa (batch culture) – stanowi ona system zamknięty,
mikroorganizmy wzrastają na określonej , ograniczonej ilości
pożywki.

Polega na:

-załadowaniu pożywki do fermentora,

-wysterylizowaniu jej wraz z aparatem,

-zaszczepieniu materiału posiewowego,

-namnażaniu mikroorganizmów.

w celu zapewnienia optymalnych warunków życia dla szczepu
produkcyjnego utrzymywana jest odpowiednia temperatura,
odpowiednia kwasowość środowiska, a hodowla jest izolowana
od innych mikroorganizmów.

iosynteza insuliny jest trzyetapowa i obejmuje hodowlę

kolbową, hodowlę posiewową oraz hodowlę produkcyjną.

Fermentacja – Warunki



Wysoka gęstość komórek w bioreaktorze

~100 [g (suchej masy)/l]



Inokulum przygotowane jest uprzednio w

kolbach z dodatkiem ampicyliny



Mieszanie z prędkością 600-900 [rpm]



Docelowe pH = 7 (Utrzymywane przez

dodawanie 4M NaOH i 4M HCl)

Fermentacja - Warunki



Temperatura procesu – 37



Docelowe stężenie tlenu w reaktorze –

40%



Szybkość aeracji – 2 [vvm]



Pożywka o niskiej zawartości glukozy



Pulsacyjna addycja glukozy do reaktora



Docelowe stężenie glukozy – 5 [g/l]



Dokarmianie rozpoczyna się po

zakończeniu wykładniczej fazy wzrostu



Możliwe jest również pulsacyjne

dozowanie alaniny i seryny

WYDZIELANIE

INSULINY



Skuteczność działania (i wartość

handlowa) bioproduktu zależy od

stopnia jego czystości



Czystość jest czynnikiem

decydującym o aktywności i

skuteczności insuliny

IZOLACJA PRODUKTU

Odwirowanie wodnego

roztworu pożywki

Dezintegracja komórki przez nadtrawienie

ścianek komórkowych i działanie wysokiego

ciśnienia

Oddzielenie zdezintegrowanej biomasy

Ciałka inkluzyjne wraz z wytworzonym

białkiem pozostają w roztworze

WIROWANIE



Wirówka ślimakowa

n = 1500 - 6000

obr/min

= 0,4 – 60 m

zawiesiny o stężeniu

2 - 50% obj.ciała

stałego

CMI MODEL EBW-36
Wirówka ślimakowa

Odzysk surowej

proinsuliny



Reakcja oksydatywnej sulfitolizy białka fuzyjnego



Przeprowadza się ją celem oddzielenia fragmentu

liderowego peptydu powstałęgo podczas sekrecji



Pozwala to na łatwiejszą obróbkę i oczyszczanie białka



Sulfonowane białko nadaje się do przeprowadzenia

reakcji łączenia łańcuchów A i B.



Przeprowadza się ją przy użyciu Na

obecności Na

(Reszty Cys przeprowadza się

w SO

celem ułatwienia dalszej obróbki)



Czas reakcji – 2-3 [h] (t.p.) lub 40 [min] (37

Oczyszczanie wstępne

Sulfonowane białko fuzyjne jest oczyszczane w

procesach:

Elektroforezy SDS-PAGE

Chromatografii afinitywnej (rozpoznającej reszty

His)

Chromatografii anionowej

Zanieczyszczenia białkowe z komórek usuwane są

na kolumnie chelatującej Ni (Sepharose)

Wydajność wstępnego oczyszczania sięga 85-95%

Dalsze oczyszczanie na kolumnie HPLC

Enzymatyczna synteza

insuliny



Cięcie proinsuliny przy użyciu:



Trypsyny (EC 3.4.21.4)



Karboksypeptydazy B (3.4.17.2)



Karboksypeptydaza jest użyta w 10-

krotnym nadmiarze (w/w)



Warunki:



pH=8.8



T=23



T=23 h

Synteza insuliny



Reakcję przerywa się poprzez dodanie 0.1 N

HCl



Uzyskaną insulinę oczyszcza się poprzez



Chromatografię (MeCN:CF

COOH)



Elektroforezę



Czystość uzyskanej insuliny bada się poprzez:



FAB-MS



Analizę aminokwasów

Gotowa insulina nadaje się do przeprowadzenia

testów biologicznych i wprowadzenia do obrotu

Literatura



J. Fiedurek;

„Podstawy wybranych procesów

biotechnologicznych”

; Wydawnictwo UMCS;

2004



W. Bednarski, J. Fiedurek;

„Podstawy biotechnologii

przemysłowej”

; WNT;

2007



W.F. Heatj, R.M. Belagaje, G.S. Brooke, R.E. Chance, J.A.

Hoffman, H.B. Long, S.G. Reams, C. Roundtree, W.N. Shaw, L.J.

Slieker, K.L. Sundell, R.D. DiMarchi;

J. Biol. Chem

;

1992

; 267;

1; 419-425



S. Jana, J.K. Deb;

Appl. Microbiol. Biotechnol

;

2005

; 67; 289-298



M. Schmidt, K.R. Babu, N. Khanna, S. Marten, U. Rinas;

Biotechnol

;

1999

; 68; 71-83



R.V. Tikhonov, S.E. Pechenov, I.A. Belacheu, S.A. Yakimov, V.E.

Klyushnichenko, E.F. Boldireva, V.G. Korobko, H. Tunes, J.E.

Thiemann, L. Vilela, A.N. Wulfson;

Protein Exp. Purificat;

2001

;

21; 176-182



G. Walsh;

Appl. Microbiol. Biotechnol

;

2005

; 67; 151-159



Document Outline