Transgenic watermelon 

rootstock resistant to 

CGMMV (cucumber

green mottle mosaic 

virus) infection

Received: 28 August 2004 / Revised: 22 February 2005 / Accepted: 23 February 2005 / Published 

online: 14 June 2005

C _Springer-Verlag 2005

Sang Mi Park · Jung Suk Lee · Sung Jegal ·
Bo Young Jeon · Min Jung · Yoon Sik Park ·
Sang Lyul Han · Yoon Sup Shin · Nam Han Her ·
Jang Ha Lee · Mi Yeon Lee · Ki Hyun Ryu ·
Seung Gyun Yang · Chee Hark Harn

• Uprawa arbuza wymaga niezbędnego 

zabiegu zwanego szczepieniem.  Jest to 
metoda uszlachetniania drzew owocowych, 
roślin ozdobnych czy warzyw.  Na podkładkę 
odmiany nieszlachetnej szczepi się  zraz 
rośliny szlachetnej. Celem tej metody 
wprowadzenie do odmiany szlachetnej lepiej 
rozbudowanego, bardziej żywotnego i 
wolnego od patogenów systemu 
korzeniowego pochodącego z podkładki 
odmiany nieszlachetnej. 

• Na rynku występuje wiele cennych 

odmian arbuza, których korzenie są mniej 

żywotne i bardziej podatne na infekcje 

wirusowe np. wirusa zielonej mozaiki 

ogórka (CGMMV) i dlatego w celu 

zmniejszenia strat wydajności uprawy 

arbuza stosuję się podkładkę z arbuza 

zwyczajnego (Citrullus lanatus), a 

metodami inżynierii genetycznej 

uzyskano podkładkę odporną na infekcję 

CGMMV. 

• Używając cDNA do podkładki arbuza 

wprowadzono gen  białka opłaszczającego  
CGMMV (CGMMV-CP). Jest to białko strukturalne 
budujące kapsyd wirusa. Pojawienie się tego 
białka powoduje to, iż późniejsza infekcja tym 
wirusem jest znacznie słabsza lub skutki choroby 
pojawiają się z dużym opóźnieniem.

Metoda transformacji 

rośliny i materiał roślinny 

wybrany do transformacji

•  

Do transformacji podkładki arbuza 

zastosowano dwie metody:  pierwsza z metod 

to kokultura zregenerowanych w stronę 

pędów liścieni w Agrobacterium tumefaciens. 

Druga z metod również opierała się na 

kokulturze zregenerowanych w stronę pędów 

liścieni w Agrobacterium tumefaciens, 

natomiast eksplantaty zostały dodatkowo 

zranione  prądem w celu ułatwienia 

przeniknięcia wektora do komórki roślinej. 

Transformacja Agrobacterium 

tumefaciens

• Szczep LBA4404 został transformowany 

używając wektora zawierającego gen CGMMV-
CP pod kontrolą promotora 35S, oraz gen 
selekcyjny NPTII oporności na kanamycynę a 
następnie przeniesiony do płynnej pożywki 
YEP.  Gdy stransformowane Agrobacterium 
urosło do fazy logarytmicznej, zostało 
zwirowane przez 10minut przy 
3500obrotów/min. Uzyskany osad bakterii 
został zawieszony w pożywce MS zawierającej 
BAP w stężeniu 1mg/l.

Materiał roślinny wybrany do 

transformacji

• Materiałem wykorzystanym do badania 

były nasiona podkładki arbuza, które 

zostały wysterylizowane przez 30sekund w 

70%  etanolu oraz w wybielaczuYuhanrox 

25%  przez 30minut. Tak wysterylizowane 

nasiona zostały przeniesione do pożywki ½ 

MS. Następnie hodowano je w ciemności w 

25°C aż do wykiełkowania. 3-dniowe 

liścienie z uzyskanych siewek zostały 

podzielone na 9 segmentów i użyte jako 

eksplantaty do regeneracji i  transformacji. 

Transformacja segmentów 

liścieni

• Eksplantaty zostały zanurzone w kulturze 

stransformowanych bakterii na 30minut. 

Następnie kokulturę umieszczono na 3dni 

do pożywki MS uzupełnionej o 1mg/l BAP, 

0,1mg/l IAA, acetosyringon który narusza 

strukturę ściany komórkowej.

• Druga  metoda była przeprowadzona 

identycznie jak pierwsza, z dodatkowym 

działaniem impulsów elektrycznych w celu 

zranienia tkanki i ułatwienia przenikania 

wektora do komórek roślinnych.

REGENERACJA + SELEKCJA

Organogeneza bezpośrednia

 1. Organogeneza w stronę pędów. 

Pożywka- zmodyfikowana MS( MS-B5 + 3% 

sacharozy + 0,8% agaru, pH 5,8)

Hormony- 1.0 mg/l BAP + 0.1 mg/l IAA
Antybiotyki- 40 mg/l kanamycyna/ 7,5 mg/l 

hygromycyna, 200 mg/l ,,lilacilline”, 500 mg/l 
cefotaksym

Czas trwania- 4-5 tygodni

 

2. Organogeneza w stronę korzeni

Pożywka- zmodyfikowana MS( MS-B5 + 3% 

sacharozy + 0,8% agaru, pH 5,8)

Hormony- brak
Antybiotyki- 20 mg/l kanamycyna, 200 mg/l 

,,lilacilline”, 

Czas trwania- 5-6 tygodni

Opis fenotypu

• Rośliny stransformowane nie odbiegają 

fenotypowo od zdrowych 
niestransformowanych roślin, nie ma różnicy 
w procesach rozwojowych. Transformanty 
hodowane na pożywce selekcyjnej z 
kanamycyną lub hygromycyną oraz rośliny 
niestransformowane owocowały i dawały 
nasiona bez zauważalnych różnic.

 

Również 

użyte dwa różne szczepy A. tumefaciens 
(LBA4404 i EHA105) nie miały wpływu na 
fenotyp transformantów.

Sprawdzenie integracji i 

ekspresji wprowadzonego 

genu

• Obecność transgenu w roślinie 

stransformowanej została 
sprawdzona następującymi 
metodami: analiza PCR, oraz 
Southern blot. Ekspresję transgenu 
na poziomie mRNA zbadano metodą 
Northern blot, natomiast na poziomie 
białka metodą Western blot.

PCR

DNA wyizolowane z transformowanych podkładek 

arbuza poddano łańcuchowej reakcji 

polimeryzacji. Do PCR zostały użyte startery o 

następujących sekwencjach:

    5_- TCCGATCACACCTAGCAAAC-3_ oraz 5_-

GACCAGACTACCGAAAACG-3_. Składnikami do 

PCR były: 0,65µM każdego ze starterów, 299 µM 

dNTP, 1U/ µM  polimerazy Taq w 50mM KCl, 

1,5mM MgCl2 oraz 10mM Tris-HCl pH 8,3. Reakcja 

została przeprowadzona w 35 cyklach, 

temperaturach: 94°C, 55°C, 72°C, odpowiednio 

do etapów reakcji (denaturacja DNA, przyłączenie 

starterów, wydłużanie nici)

Southern blot

• DNA wyizolowane z 

transformowanych podkładek arbuza 
trawiono enzymem XbaI i 
frakcjonowano na 0,8% żelu 
agarozowym.

Northern blot

• Pozytywne(posiadające transkrypt) 

produkty z PCR poddano analizie 

Badanie oporności roślin T1 na 

CGMMV

• W celu zbadania oporności transgenicznego arbuza na 

infekcję CGMMV doprowadzono do samozapylenia rośliny 
T0 106 i uzyskano 140 roślin T1. Czterotygodniowe siewki 
poddano dwukrotnej inokulacji wirusem CGMMV z 
dwutygodniowym odstępem 

Wnioski

-Arbuz jest jedną z najtrudniejszych roślin do transformacji za 

pomocą Agrobacterium. 
- Do transformacji użyto dwóch metod: zwykła kokultura(z 

kanamycyną jako antybiotyk selekcyjny) i metoda kokultury ze 

zranioną prądem tkanką. (z hygromycyną jako antybiotyk 

selekcyjny). Wydajność transformacji wynosiła odpowiednio 0,1% 

oraz 0,3%. Okazało się, że obie metody transformacji 

charakteryzuje się bardzo niską wydajnością. Wydajność jest 

większa w przypadku drugiej metody, co może być powodem 

dodatkowego ranienia impulsem elektrycznym eksplantatów, 

dzięki czemu więcej bakteryjnego DNA mogło być 

przetransportowanych do komorek. Aklimatyzacja również okazała 

się niełatwym zadaniem, wiele stransformowanych roślin nie 

przetrwało tego procesu. Ponadto niższą wydajność aklimatyzacji 

obserwujemy w przypadku roślin potraktowanych prądem, który 

mógł uszkodzić bądź naruszyć strukturę komórek eksplantatu.

- 

Badania wykazały że nie ma korelacji pomiędzy 

opornością a obecnością transktryptu i białka. 
Autorzy puplikacji proponują trzy możliwe 
mechanizmy które tłumaczą powyższe 
zjawisko. Po pierwsze, gen który został 
wklejony i podlega transkrypcji zostaje 
potranskrypcyjnie wyciszony. Po drugie białko 
CP które zapobiega replikacji RNA wirusa, nie 
podlega ekspresji w pokoleniu T1. Po trzecie, 
na poziom oporności może mieć wpływ 
zmienność somaklonalna. 

Dziękujemy za uwagę!

• Sandra Kupczyk
• Roman Majewski