Biotechnologia roślin

Metody otrzymywania form haploidalnych,

cd.

Kultury in vitro zarodków, zalążków i

zalążni w hodowli roślin ozdobnych

Kultury pylnikowe i mikrospor

Metody oparte na zjawisku eliminacji
chromosomów

Kultura zarodków, zalążków i zalążni

Wykład 2

Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa w Sulechowie

2007

Biotechnologia roślin ogrodniczych

 stanu fizjologicznego rośliny, z
której pobierane są pylniki
 sposobu traktowania ściętych

kwiatostanów przed

wyłożeniem

pylników na

pożywkę
 stadium rozwojowego pyłku
 komponentów pożywek
indukcyjnych i regeneracyjnych
 warunków fizycznych hodowli
pylników

Jest to proces złożony, zależny od wielu
czynników:

Androgeneza cd.

Linie DH

Linie podwojonych haploidów (linie

DH) są to formy powstałe w wyniku

podwojenia liczby chromosomów u

haploidów.



Podwajanie liczby chromosomów u

haploidów

przeprowadza

się

najczęściej przy użyciu kolchicyny.

Metody otrzymywania form haploidalnych z

wykorzystaniem zjawiska eliminacji

chromosomów



Zjawisko eliminacji chromosomów zachodzi w

komórkach zarodka uzyskanego z krzyżowań
międzygatunkowych



Z początkowo normalnie rozwijającego się zarodka
mieszańcowego eliminowane są chromosomy tylko
jednego gatunku



Eliminacja chromosomów zachodzi również w bielmie,
co powoduje jego złe funkcjonowanie i zamieranie



Brak bielma uniemożliwia rozwój zarodka (zarodek
pozbawiony jest substancji odżywczych)



Technika ta wymaga więc prowadzenia zarodków w
kulturze in vitro



Przeniesienie zarodka na
pożywkę

sztuczną

zastępującą

bielmo pozwala również uzyskać
wiele

różnych

mieszańców

międzygatunkowych.

Kultura niezapłodnionych

zalążków



Jest  to  metoda  alternatywna  do  techniki
uzyskiwania  haploidów  drogą  androgenezy.
Wykorzystuje  się  tu  zjawisko  gynogenezy,
czyli  rozwoju  zarodków  z  niezapłodnionych
komórek gametofitu żeńskiego w warunkach
kultury  in  vitro  zarodków).  U  roślin
ozdobnych      stosunkowo  łatwo  jest  uzyskać
haploidy tą techniką  u Gerbery



Kultury

in vitro

zarodków, zalążków i zalążni w

praktycznej hodowli roślin ozdobnych



W/w techniki stosuje się w celu otrzymania
mieszańców o pożądanej kombinacji cech z
form rodzicielskich wykazujących bariery
samoniezgodności



W`wielu przypadkach bariery te można
przezwyciężyć stosując metody kultur in vitro



Otrzymywanie mieszańców z form

rodzicielskich wykazujących

samoniezgodność



Bariery niezgodności ujawniają się w różnych
stadiach cyklu rozwojowego

w momencie zetknięcia pyłku z znamieniem

przerastania łagiewek przez szyjkę lub po
dotarciu do zalążka

po zapłodnieniu

podczas embriogenezy.

Przykłady wykorzystania kultury

in vitro

zarodków, zalążków i zalążni w hodowli roślin

ozdobnych

LILIE



Krzyżowania międzygatunkowe w hodowli lilii
prowadzi się w celu:

Uatrakcyjnienia barwy i kształtu kwiatów

Podwyższenia odporności na choroby

Podwyższenia odporności na stresy
abiotyczne.

Przykłady wykorzystania kultury

in vitro

zarodków,

zalążków i zalążni w hodowli roślin ozdobnych

Lilie, cd



Krzyżowano odmiany lilii uprawnych między
innymi z następującymi gatunkami:

L. candidum – z uwagi na czystą biel kwiatów,
zapach, tolerancję na niskie temperatury i małą
intensywność światła

L. longiflorum – ze względu na możliwość
całorocznego pędzenia, tolerancję na krótki
dzień, dobrą jakość przechowalnicza cebul, siłę
wzrostu i atrakcyjny zapach

L. henryi – odporność na choroby wirusowe i
grzybowe

Przykłady wykorzystania kultury

in vitro

zarodków, zalążków i zalążni w hodowli roślin

ozdobnych

Lilie , cd



Dla otrzymania mieszańców stosowano szereg
zintegrowanych technik, między innymi
kulturę całych zalążni, zalążków lub zarodków.



Z 500 wyłożonych na pożywkę zalążków
otrzymuje się średnio 1 roślinę mieszańcową



Wśród uzyskanych mieszańców znajdowano
formy o podwyższonej odporności na choroby,
ciekawym pokroju i barwie kwiatów

Przykłady wykorzystania kultury

in vitro

zarodków, zalążków i zalążni w hodowli roślin

ozdobnych

Tulipan



Uprawiane na kwiat cięty tulipany należą do
gatunku Tulipa gesenariana



Pomimo zróżnicowanej gamy kolorów, wysokości
i kształtu kwiatów brakuje u tego gatunku źródeł
odporności na choroby



Odporność na choroby próbuje się wprowadzić
między innymi poprzez krzyżowania z T.
kaufmaniana



Uzyskanie form mieszańcowych jest możliwe
tylko poprzez kulturę in vitro zarodków (7-9
tygodniowych)

Przykłady wykorzystania kultury

in vitro

zarodków, zalążków i zalążni w hodowli roślin

ozdobnych

Róża



Podstawowymi problemami w hodowli róż są
trudności w uzyskaniu nasion zarówno z
krzyżowań między –jak i
wewnątrzgatunkowych, niska żywotność i
słabe kiełkowanie nasion.



Pomocne w przezwyciężeniu tych technik są:
kultura zalążków i zarodków

Zapylanie

in vitro

zalążni i zalążków



Niezgodność gatunkowa często uniemożliwia uzyskanie
metodami klasycznymi interesujących hodowcę form



Bariery niekrzyżowalności można omijać poprzez
zapylanie in vitro zalążni lub zalążków



Pozwala to na:

ominięcie barier samoniezgodności i uzyskanie nowych
rekombinantów roślin

uzyskanie poprzez indukcję partenogenezy form
haploidalnych

Przygotowanie materiału



Zapobieżenie niekontrolowanemu zapyleniu



Sterylizacja materiału (odpowiednich dla danego
gatunku eksplantatów np. słupki, słupki z szypułką
kwiatową i fragmentami okwiatu



Przygotowanie pyłku do zapylenia

Przykłady wykorzystania



Larix



Picea



Pinus



Cayophyllaceae



Liliaceae



Malvaceae



Primulaceae

Kultura zarodków u roślin z prawidłowo

rozwijającym się bielmem



Kulturę zarodków prowadzi się w celu:

Przerwania okresu spoczynkowego nasion

Przyspieszenia okresu rozwojowego roślin

Oceny żywotności nasion

Przerwanie okresu spoczynkowego nasion



Okres

spoczynku

nasion

jest

cechą

indywidualną i charakterystyczną dla danego
gatunku.



W  rodzaju  Irys  okres  spoczynku  wynosi  do
kilkudziesięciu  miesięcy.  Przerwanie  okresu
spoczynku  nasion  można  uzyskać  między
innymi  poprzez  izolację  zarodków  z  nasion  na
pożywki sztuczne.



Kultury in vitro zarodków u chryzantem
pozwalają na uzyskanie trzech pokoleń rocznie

W praktyce często zamiast izolować zarodki,

przenosi się całe zalążki zawierające
zarodki

wczesnych

stadiach

embriogenezy.

przypadku

roślin

ozdobnych

technika

znalazła

wykorzystanie  w  takich  gatunkach  jak
Pisum,  Helianthus,  Glycine.  Technika  ta
jest  szczególnie  przydatna  w  produkcji
siewek  storczyków,  z  uwagi  na  bardzo
małe nasiona tego gatunku.

Selekcja w kulturach in vitro



Warunkiem

skuteczności

selekcji

kulturze  in  vitro  jest  występowanie
korelacji  między  reakcją  komórki  lub
tkanki  w  kulturze,  a  reakcją  otrzymanej  z
niej  rośliny.  Selekcja  jest  prowadzona
zazwyczaj

przy

użyciu

czynnika

selekcyjnego.

przypadku

hodowli

odpornościowej

mogą

być

np.

mykotoksyny

hodowli

suszę

określone sole.

Zalet

selekcji w kulturze in vitro



-możliwość oceny dużej liczby komórek lub
osobników na małej powierzchni (przy założeniu iż
istnieje

szansa

znalezienia

korzystnego

rekombinanta z częstotliwością 1:10000, u ogórka
10 płytek Petriego o średnicy 6 cm zastępuje 30 ha
doświadczeń polowych)



-możliwość badania wielu osobników równocześnie



-uniezależnienie się od występowania interakcji
genotypowo-środowiskowej



-ochrona środowiska przed szkodliwością czynnika
selekcyjnego



W obrębie rośliny zainfekowanej znajdują się komórki,

grupy komórek a nieraz tkanki, w których nie można

wykryć wirusa dostępnymi metodami.



Stwierdzono, iż znaczna część roślin zregenerowanych

z tych fragmentów jest wolna od patogenów.



Możliwość uwolnienia od wirusów roślin rozmnażanych

wegetatywnie zapoczątkowało lawinowy rozwój kultury

merystemów



Opracowano procedury izolacji odpowiednio małych

wierzchołków pędu

walnianie roślin od wirusa



Poprzez kultury in vitro merystemów
wierzchołkowych

istnieje

możliwość

eliminowania wirusów z tkanek roślinnych.
W

przypadku

przeniesienia

komórek

zainfekowanych wirusem na pożywki, często
wirusy są eliminowane samorzutnie. Istnieją
jednak  wirusy  tzw.  uporczywe,  do  których
zwalczania  konieczne  jest  zastosowanie  w
kulturach  in  vitro  dodatkowo  chemoterapii
lub/i  termoterapii.

Metody eliminowania wirusów

1.Kultura in vitro

merystemów

2. Chemoterapia
3. Termoterapia
4. Krioterapia

Odkażanie materiału roślinnego

Inkubacja w temp. 18-22 stopni C na
świetle

Pasaże co 2-3 tygodni

Przesadzanie roślin do ziemi

Testowanie na zdrowotność

Etapy odwirusowywania
roślin drogą izolowanych
merystemów

Rodzaje kultury merystemów



1. Podział roślin na sadzonki węzłowe



Przydatna w masowej produkcji roślin
ozdobnych i sadowniczych. Polega na pocięciu
rośliny na fragmenty zawierające pęd z
węzłem oraz znajdującymi się w węźle liśćmi
oraz pąkami bocznymi. Uzyskane sadzonki
węzłowe pasażuje się na kolejne pożywki.



Szeroko wykorzystywane w mikrorozmnażaniu
Astromeria, Cymbidium, Gloriosa



Schemat
mikrorozmnażania z
wierzchołka pędu
górny rząd:
A- budowa pąka
wierzchołkowego i
bocznego pędu
B – eksplantat służący
do uwolnienia rośliny
od patogenów,
C i D – eksplantaty
wykorzystywane do
mikrorozmnażania,
wierzchołek pędu i pąk
boczny;
dolny rząd:
E – mikrorozmnażanie
roślin o wzroście
wydłużonym,
F – o wzroście
rozetowym



Kultura poliferujących zarodków



Poprzez dodanie do pożywki cytokinin w
dużym stężeniu uzyskuje się tzw. wieloroślinki.
Ponowne podziały i pasaże pozwalają na
uzyskanie tysięcy roślin potomnych



Szeroko stosowana do rozmnażania Dianthus,
Chrysanthemum, Rosa multiflora i wielu
innych.

walnianie roślin od wirusa



Istnieją

jednak

wirusy

tzw.

uporczywe,  do  których  zwalczania
konieczne  jest  zastosowanie  w
kulturach  in  vitro  dodatkowo
innych procedur  .

Terapia in vitro



Pod

wpływem

długotrwałego

działania

podwyższoną temperaturą ( w granicach 26-

45 stopni C. w czasie od 1-3 miesięcy)

następuje inaktywacja wirusów w tkankach

rośliny. Terapii cieplnej poddaje się całe

rośliny lub ich organy wegetatywne. Po

zakończeniu procesu termoterapii, z roślin

tych pobiera się tkanki merystematyczne i

dalej prowadzi kulturę in vitro w celu

uzyskania

roślin.

Metoda

znalazła

zastosowanie

między

innymi

odwirusowywania chryzantem i goździków.

Chemoterapia -



Chemoterapia  polega  na  dodaniu  do
pożywki  tzw.  antymetabolitów,  czyli
substancji  o  wysokiej  aktywności
przeciwwirusowej.  Są  to  substancje
włączające się w metabolizm wirusów
i  wywołujące  zmiany  w  kodzie
genetycznym

RNA

wirusowego,

hamując ich rozmnażanie się.

Sztuczne nasiona



-produkt  składający  się  z  zarodka
somatycznego  lub  zaczątku  rośliny
umieszczony  w  osłonce  ochraniająco  -
odżywczej, zdolny do regeneracji roślin
na skale komercyjną.



Najczęściej występują jako toczkowane
odwodnione zarodki somatyczne lub
uwodnione

zarodki

otoczce

hydrożelowej

Kultury protoplastów

Protoplastem nazywamy komórkę roślinną

pozbawioną ściany komórkowej, najczęściej
wskutek  trawienia  enzymami.  Za  pomocą
łączenia  protoplastów  różnych  gatunków
można  otrzymać  mieszańce  somatyczne
między odległymi systematycznie roślinami.



Mieszańce somatyczne są to komórki i
zregenerowane z nich rośliny otrzymane w
wyniku

fuzji

protoplastów

komórek

somatycznych

Kultury protoplastów



Kultury

protoplastów

pozwalają

otrzymywanie mieszańców somatycznych
nie

tylko

przez

połączenie

jąder

komórkowych, ale również przez zlanie się
cytoplazmy

partnerów,

wnoszące

dodatkowo

cechy

dziedziczone

plazmatycznie (poprzez informację zawartą
w mitochondriach i chloroplastach).



Mieszańce somatyczne



W procesie otrzymywania mieszańców

somatycznych

wyróżniamy

następujące

etapy:



-izolacja i zmieszanie ze sobą protoplastów

form przeznaczonych do fuzji



-fuzja

protoplastów

spowodowana

czynnikami

powodującymi

bezpośredni

kontakt błon protoplastów (czynnikami

chemicznymi

lub

elektrofuzją),

ich

odwracalne niszczenie i odbudowanie



-identyfikacja

selekcja

komórek

mieszańcowych



-kultura in vitro komórek mieszańcowych i

regeneracja roślin.

Kultury protoplastów



Bezpośrednio po fuzji cytoplazma
komórek

mieszańcowych

zawiera

wszystkie  organelle  obu  komponentów
fuzji.  Z  upływem  czasu  skład  takiej
komórki znacznie się zmienia, tak że w
końcu  powstają  na  ogół  komórki  o
składzie

genetycznym

znacznie

różniącym się od wyjściowego.

Document Outline