Mysi model nowotworów jelit

• Rak jelita grubego jest jednym z najczęściej

występujących

nowotworów

złośliwych,

zarówno u kobiet, jak i u mężczyzn.

• W krajach rozwiniętych, pod względem

śmiertelności, zajmuje on drugie miejsce.

• Chorobami prowadzącymi do rozwoju raka

jelita grubego są m.in.:

- rodzinna polipowatość gruczolakowata
- dziedziczna niezwiązana z polipowatością

postać raka jelita grubego

- nieswoiste zapalne choroby jelit

Rodzinna polipowatość

gruczolakowata (familiar

adenomatous polyposis, FAP)

• FAP jest chorobą autosomalną dominującą, w

której  wiele  polipów  gruczolakowatych  rozwija
się w okrężnicy, rzadziej w proksymalnej części
jelita.  Choroba  ta  często  prowadzi  do  rozwoju
raka  jelita  grubego.  Badania  genetyczne
wykazały,  że  za  rozwój  FAP  odpowiada
inaktywacja

genu

APC

(antyonkogenu),

zlokalizowanego na chromosomie 5q21.

• Pacjenci z FAP często chorują także na inne

nowotwory, np. twardego włókniaka skóry,
rdzeniaka czy kostniaka.

• Mysie modele FAP posiadają heterozygotyczną

mutację w genie Apc.

• Modele

są

wartościowym

narzędziem

wykorzystywanym  w  badaniach  nad  procesem
nowotworzenia  w  jelitach,  ponieważ  większość
sporadycznych  ludzkich  nowotworów  posiada
mutacje inaktywujące gen APC.

• Myszy Apc

+/-

, takie jak Apc

Min/+

, rozwijają

nowotwory głównie w jelicie cienkim, podczas
gdy ludzie chorują głównie na nowotwory jelita
grubego.

Myszy Min

• Pierwszym mysim modelem FAP noszącym

mutację  w  genie  Apc,  był  model  Min  (multiple
intestinal  neoplasia,  gruczolakowatość  jelitowa).
Myszy  Apc

Min/+

są heterozygotyczne pod kątem

mutacji w genie Apc. Mutacja ta jest dziedziczona
w  sposób  autosomalny  dominujący  i  prowadzi  do
powstania  skróconej  formy  białka.  Podobnie  jak
pacjenci  z  FAP,  myszy  Apc

Min/+

rozwijają liczne

polipy gruczolakowate. Wszystkie guzy tracą z
czasem dziki allel Apc.

• W przeciwieństwie do pacjentów z FAP, którzy

rozwijają gruczolakoraki w okrężnicy, większość
gruczolakoraków u myszy Apc

Min/+

znajduje się w

jelicie cienkim.

• Z powodu krwawienia z jelita oraz ciężkiej

anemii, myszy Min rzadko żyją dłużej niż 140
dni.

Apc

1638N

• Do genomu myszy Apc

1638N

wstawiono kasetę

ekspresyjną dla neomycyny. Myszy te wykazują
fenotyp predysponujący do nowotworzenia.
Rozwijają

się

nich

jelitowe

ogniska

nieprawidłowych krypt oraz kilka polipów ok. 10-
16  tygodnia  życia.  Ok.  25-30  tygodnia  życia
rozwijają  się  guzy  jelita  cienkiego.  Jelito  cienkie
wykazuje  znaczną  hiperplazję  oraz  przejście  od
gruczolaka do raka.

Myszy Apc

D14/+

• Nowy mysi model FAP, Apc

D14/+

, posiada

heterozygotyczną  delecję  eksonu  14  genu  Apc,
która  prowadzi  do  ostrej  jelitowej  polipowatości.
Stopień  nasilenia  fenotypu  zależy  od  sposobu
hodowli  myszy  sugerując,  że  mikrośrodowisko
jest  istotnym  czynnikiem  dla  rozwoju  polipów
jelitowych.

Podstawową

różnicą

pomiędzy

myszami Apc

Min/+

,a Apc

D14/+

jest to, że polipy u

myszy Apc

D14/+

znajdują się w jelicie grubym.

• Większość

mysich

mutantów

Apc

rozwija

gruczolakowate polipy w jelicie cienkim, a nie w
grubym. Jednakże dodatkowa mutacja w genie Cdx2 u
myszy Apc

Δ716

zmienia lokalizację rozwoju polipów.

Większość polipów rozwija się u tych myszy w jelicie
grubym, podobnie jak u ludzi z FAP.

• U większości mysich modeli Apc rozwijają się polipy

gruczolakowate,  ale  nie  przechodzą  one  w  inwazyjne
lub  przerzutujące  gruczolakoraki  ze  znaczącą
częstością.  Mutacje  w  innych  genach  mogą  zmienić
progresję nowotworów u myszy Apc. Mutacja w genie
Smad4 u myszy Apc

Δ716

powoduje rozwój inwazyjnego,

przerzutującego gruczolakoraka. Co ważne, polipy
jelitowe u tych myszy szybko przekształcają się w
bardzo inwazyjne gruczolakoraki.

Dziedziczna niezwiązana z

polipowatością postać raka jelita

grubego (hereditary nonpolyposis

colorectal cancer, HNPCC)

• HNPCC jest chorobą dziedziczoną w sposób

autosomalny

dominujący

kryterium

diagnostycznym, zwanym kryterium Amsterdamskim,
które  obejmuje  3  lub  więcej  zaatakowanych  przez
chorobę  członków  rodziny  w  2  lub  więcej
następujących  po  sobie  pokoleniach  z  co  najmniej  1
członkiem rodziny zdiagnozowanym przed 50 rokiem
życia.

• Do spektrum fenotypowego zalicza się wczesne

wystąpienie raka jelita grubego, z lub bez raka
endometrium, żołądka, jelita cienkiego, dróg
moczowych czy jajnika.

• Spektrum nowotworów pozwala na podział HNPCC

na zespoły chorobowe:
Lynch I – obecny tylko rak jelita grubego
Lynch II – obecne są dodatkowe nowotwory

• Chorzy z HNPCC są nosicielami heterozygotycznych

mutacji w genach naprawy MMR, jednakże, kiedy
guz się rozwija, najczęściej tracą dziki allel poprzez
somatyczne procesy i w konsekwencji są podatni na
błędy replikacji w sekwencjach powtarzających się.

Myszy ze zmutowanymi homologami

MutS

•

Fenotyp myszy linii Msh2

-/-

jest ostrzejszy niż u myszy

Msh3

-/-

czy Msh6

-/-

. Inaktywacja genu Msh2 powoduje

gwałtowny spadek przeżywalności myszy. Podczas
gdy heterozygotyczne myszy Msh2 posiadają
normalną

długość

życia,

50%

myszy

homozygotycznych umiera w wieku 6 miesięcy,
wszystkie umierają do ok. 11-12 miesiąca życia.
Spadek przeżywalności u myszy Msh2

-/-

jest związany

z  wysoką  predyspozycją  do  rozwoju  nowotworów.
Zwierzęta  które  dożywają  6  miesiąca  rozwijają
gruczolaki  oraz  gruczolakoraki  jelita  cienkiego.
Część  z  tych  zwierząt  rozwija  również  raka
gruczołów łojowych.

• Myszy Msh2

GA/GA

wykazują silną predyspozycję

do  rozwoju  nowotworów.  Rozwija  się  u  nich
chłoniak  z  limfocytów  T,  jelitowy  gruczolakorak
oraz  rak  płaskokomórkowy,  podobnie  jak  u
myszy Msh2

-/-

• Jednakże, 50% stopień przeżycia różni się

pomiędzy tymi modelami (6 miesięcy dla Msh2

-/-

oraz 9-10 miesięcy dla Msh2

GA/GA

), wskazując na

to, że zależny od MMR szlak sygnalizujący
uszkodzenie DNA jest istotny dla supresji
wczesnych etapów nowotworzenia.

• Analiza myszy Msh6

-/-

pozwoliła na stwierdzenie,

że

gen

ten

jest

genem

podatności

odpowiedzialnym  za  opóźniony  rozwój  choroby.
Inaktywacja  tego  genu  u  myszy  powodowała
silną  predyspozycję  do  nowotworzenia,  ze
spektrum  nowotworów  podobnym  do  myszy
Msh2

-/-

. Jednakże początek rozwoju nowotworów

u myszy Msh6

-/-

jest opóźniony i zwierzęta

przeżywają do 16 miesiąca życia. Fenotyp myszy
Msh6 sugeruje, ze u ludzi mutacje w genie MSH6
są związane z późniejszym rozwojem choroby.

• Mutacje MSH6 są często związane z atypowym

HNPCC,  który  charakteryzuje  się  rozwojem
choroby  w  wieku  60  lat  lub  późniejszym.
Ponadto,  myszy  Msh6

-/-

rozwijają raka macicy,

który również jest obecny u znacznej liczby
pacjentów z mutacjami w genie MSH6.

Mysie mutanty homologów MutL

• Inaktywacja genu Mlh1 u myszy prowadzi do

zredukowanej

przeżywalności

silnej

predyspozycji do rozwoju nowotworów, podobnie
do myszy Msh2

-/-

, ze spektrum nowotworów

zawierającym

chłoniaki

komórek

gruczolakoraki jelita i raka skóry.

• Inaczej niż u pacjentów z HNPCC mających mutacje w

genach  MSH2,  MSH6  i  MLH1,  heterozygotyczne
myszy  mające  mutacje  w wymienionych wyżej genach
maja  opóźniony  rozwój  choroby.  Homozygotyczne
myszy  Msh2,  Msh6  i  Mlh1  są  wysoce  podatne  na
rozwój guzów, ze spektrum nowotworów zawierającym
raki  przewodu  pokarmowego,  ale  w  przeciwieństwie
do  pacjentów  z  HNPCC,  większość  myszy  umiera
przedwcześnie z powodu agresywnych chłoniaków.

• Choroba Crohn’a (CD, ang. Crohn’s disease) oraz

wrzodziejące

zapalenie

okrężnicy

(UC,

ang.

ulcerative  colitis)  są  to  przewlekłe  choroby  zapalne
jelita,  które  są  również  nazywane  nieswoistymi
zapalnymi  chorobami  jelit  (IBD,  ang.  inflammatory
bowel  disease).  Etiologia  IBD  nie  jest  w  pełni
poznana,  ale  uważa  się,  że  złożone  oddziaływania
pomiędzy czynnikami genetycznymi, środowiskowymi
i  immunologicznymi  są  odpowiedzialne  za  inicjację  i
progresję choroby.

• Wyniki badań nad IBD sugerują, że nadmierna

odpowiedź  immunologiczna  gospodarza  przeciwko
antygenom  komensali  jelitowych  jest  głównym
powodem  rozwoju  IBD  oraz  zniszczenia  śluzówki
zarówno w UC, jak i CD.

• Jednakże, pomimo, że choroby te dzielą pewne

efektorowe szlaki, CD i UC są immunologicznie i
histopatologicznie odmienne.

• Istnieją dowody wskazujące na to, że przewlekłe

zapalenie  u  pacjentów  z  UC  jest  związane  z
odpowiedzią  immunologiczną  Th2,  która  jest
związana z dysfunkcją bariery nabłonkowej. Inaczej
jest  w  przypadku  pacjentów  z  CD,  u  których
wykryto  podwyższony  poziom  cytokin  IFN-γ,  IL-2
oraz TNF-α w jelicie, co jest charakterystyczne dla
odpowiedzi typu Th1.

• Postęp w rozumieniu odporności śluzówkowej

został osiągnięty dzięki badaniom nowych
eksperymentalnych

modeli

zwierzęcych

zapalenia jelitowego.

• Większość z tych modeli powstała poprzez

indukcję

chemiczną,

transfer

komórek

immunologicznych  czy  modyfikacje  genetyczne.
Tylko  u  nielicznych  modeli  choroba  rozwija  się
bez jakichkolwiek zewnętrznych manipulacji.

1. Defekty w

przepuszczalności/integralności nabłonka

• Jednowarstwowy nabłonek jelitowy jest fizyczną i

immunologiczną

barierą,

która

zapobiega

bezpośredniemu  kontaktowi  jelitowej  śluzówki  z
mikroorganizmami  znajdującymi  się  w  świetle
jelita. Niewłaściwie funkcjonująca bariera jelitowa
może  odgrywać  istotną  rolę  w  rozwoju  IBD,
poprzez  umożliwienie  wniknięcia  antygenów  i
mikroorganizmów znajdujących się w świetle jelita
do śluzówki i inicjację silnej odpowiedzi zapalnej.

Zapalenie okrężnicy wywołane DSS

• Podawanie myszom przez kilka dni polimerów DSS

w wodzie pitnej indukuje wysoce powtarzalne ostre
zapalenie  okrężnicy  charakteryzujące  się  krwawą
biegunką,  owrzodzeniem  oraz  infiltracją  przez
granulocyty.  Uważa  się,  że  DSS  jest  bezpośrednio
toksyczny

dla

komórek

nabłonkowych

podstawowych krypt jelita i w ten sposób wpływa na
integralność bariery śluzówkowej.

• Model ostrego zapalenia okrężnicy wywołanego DSS

jest użyteczny w badaniach wpływu mechanizmów
odporności

wrodzonej

rozwój

zapalenia

okrężnicy. Ponadto, model DSS okazał się użyteczny
do badania mechanizmów naprawy nabłonkowej.

• U

podatnych

szczepów,

podawanie

DSS

kilkukrotnych  cyklach  (np.  7  dni  DSS,  14  dni  woda)
powodowało  rozwój  przewlekłego  zapalenia  okrężnicy
i  gdy  podawano  DSS  z  pojedynczą  wstępną  dawką
genotoksycznego  kancerogenu  jelita  grubego  AOM
(azoksymetan), prowadziło to do rozwoju związanego z
zapaleniem raka jelita grubego.

• Ponieważ zapalenie jelita grubego prawdopodobnie

odgrywa  istotną  rolę  w  rozwoju  raka  jelita  grubego
związanego  z  IBD,  model  AOM/DSS  jest  niezwykle
użytecznym  narzędziem  poznawczym  dla  badania
mechanizmów  łączących  zapalenie  z  procesem
nowotworzenia w jelicie grubym.

Zapalenie okrężnicy wywołane

TNBS/oksazolonem

•

Zapalenie okrężnicy może być indukowane w
podatnych szczepach myszy poprzez doodbytnicze
wkroplenie

TNBS/DNBS

lub

oksazolonu

rozpuszczonych  w  etanolu.  Etanol  jest  niezbędny  do
przełamania  bariery  śluzówkowej,  podczas  gdy
TNBS/oksazolon prawdopodobnie wiąże się jako hapten
z  autologicznymi  jelitowymi  lub  drobnoustrojowymi
białkami  powodując,  że  są  one  immunogenne  dla
systemu immunologicznego gospodarza.

•

Wykazano,  że  komórki  T  CD4+  odgrywają  kluczową
rolę  w  przewlekłym  zapaleniu  okrężnicy  indukowanym
TNBS. Model ten jest więc użyteczny w badaniach nad
odpowiedzią  immunologiczną  śluzówki  zależną  od
komórek Th.

•

Model  zapalenia  okrężnicy  TNBS  jest  użyteczny  w
badaniach  wielu  istotnych  aspektów  zapalenia  jelita,
wliczając  tu  wzór  sekrecyjny  chemokin,  mechanizmy
ustnej tolerancji, adhezję komórek czy immunoterapię.

•

Zapalenie  okrężnicy  wywołane  oksazolonem  jest
jednym  z  niewielu  modeli  odpowiednich  do  badania
wpływu  odpowiedzi  immunologicznej  Th2-zależnej  na
zapalenie jelitowe. Tak jak w modelu TNBS, zapalenie
okrężnicy  wywołane  oksazolonem  jest  zależne  od
rodzaju  szczepu  myszy  i  wymaga  indywidualnej
optymalizacji.

•

Jest to potwierdzone przez fakt, że małe dawki
oksazolonu mogą indukować zapalenie okrężnicy
Th1/Th2-zależne.

Myszy transgeniczne DN N-kadheryna

• Interesującym modelem dostarczającym bezpośrednich

dowodów na to, że nienaruszona bariera nabłonkowa jest
istotna

dla

homeostazy

śluzówkowej,

są

myszy

transgeniczne/chimeryczne,  u  których  występuje  ekspresja
zmutowanego  białka  adhezyjnego  komórek  –  N-kadheryny  –
w  komórkach  nabłonkowych  jelita  wzdłuż  osi  kosmka  krypty
jelitowej.

• Myszy

rozwijają

obszarach

nabłonka

chimerycznego/przepuszczającego  przewlekłe  IBD,  a  w
późniejszym czasie również nowotwory jelita. Obserwacja, że
zapalenie  pojawia  się  tylko  w  sąsiedztwie  nieszczelnych
komórek nabłonkowych jest bezpośrednim dowodem na to, że
wniknięcie  antygenów  prawidłowej  mikroflory  śluzówkowej
jest  wystarczające  do  indukcji  odpowiedzi  prowadzących  do
zapalenia okrężnicy.

Myszy SAMP1/YitFc (Samp)

•

Model

ten

jest

znakomitym

eksperymentalnym

narzędziem do badania mechanizmów choroby Crohn’a,
ponieważ  zapalenie  pojawia  się  spontanicznie  i  jest  to
jeden  z  nielicznych  modeli  z  ostrym  zapaleniem  w
terminalnej  części  jelita  krętego,  pierwotnej  lokalizacji
zmian patologicznych CD.

•

zmiany

patologiczne

charakteryzują

się

pełnościennym zapaleniem, ziarniniakami i zmianami w
morfologii nabłonka.

• W przeciwieństwie do innych modeli myszy

SAMP przetrzymywane w warunkach wolnych
od mikroorganizmów rozwijają zapalenie
jelita, aczkolwiek w mniejszym wymiarze.

• Zwiększona

przepuszczalność

nabłonka

poprzedza początek zapalenia i uważa się, że
dysfunkcja komórek nabłonkowych może być
główną

przyczyną

progresji

choroby.

Jednakże,

należy

określić

czy

defekty

przepuszczalności nabłonka obserwowane u
tych myszy są przyczyną czy konsekwencją
zapalenia jelita krętego.

2. Defekty komórek odporności

wrodzonej

• Badania na modelach zwierzęcych przyczyniły się

znacznego

wzrostu

ilości

dowodów

potwierdzających przypuszczenie, że nadmierna
aktywacja

komórek

odpornościowych

lub

niewłaściwa

odpowiedź

dalszych

szlaków

regulatorowych są w dużym stopniu zaangażowane
w indukcję zapalenia śluzówkowego.

Niedobór STAT3 w komórkach szpiku

• Myszy ze specyficzną modyfikacją w genie STAT3

makrofagów i neutrofili rozwijają spontaniczne
zapalenie jelita cienkiego i okrężnicy. Choroba z
pełnościennymi

patologicznymi zmianami i

wysoką częstością gruczolakoraka jelita grubego
rozwija się u myszy, które są w wieku kilku
miesięcy. Zapalenie jelita cienkiego i okrężnicy u
tych myszy jest zależne od obecności komórek
odporności adaptacyjnej oraz obecności IL-12.

Myszy z niedoborem A20

• A20 jest indukcyjnym i ulegającym wysokiej

ekspresji  białkiem  cytoplazmatycznym,  które  jest
inhibitorem  aktywności  NFκB  indukowanego
przez  TNF.  Myszy  z  niedoborem  A20  rozwijają
spontaniczne

zapalenie,

kacheksję

przedwcześnie

umierają,

części

przez

niezdolność komórek z niedoborem A20 do
terminacji odpowiedzi NFκB.

Myszy transgeniczne STAT4

• STAT4

jest

regulatorowym

czynnikiem

transkrypcyjnym,

szczególnie

związanym

sygnalingiem receptora dla IL-12/IL-23. Myszy z
nadekspresją

STAT4

pod

kontrolą

promotora

cytomegalowirusowego

rozwijają

ciężką

postać

pełnościennego  zapalenia  okrężnicy.  Przenikające
płytkę własną komórki T CD4+ tych myszy produkują
po  stymulacji  αCD3/αCD28  in  vivo  i  in  vitro  przede
wszystkim  TNF-α  oraz  IFN-γ,  ale  nie  IL-4,  zgodnie  z
odpowiedzią  komórkową  typu  Th1.  To  wskazuje,  że
niewłaściwa aktywacja szlaku efektorowego Th1 może
być  wystarczająca  do  zniszczenia  śluzówkowej
równowagi immunologicznej.

Myszy TCRα

−/−

• Myszy

deficytem

łańcucha

TCR-α

spontanicznie rozwijają śluzówkowe zapalenie
w

wieku

12-16

tygodni,

pewnymi

charakterystycznymi cechami podobnymi do
UC u ludzi. Przeważa patologiczna odpowiedź
immunologiczna typu Th2 w przewodzie
żołądkowo-jelitowym tych myszy.

Document Outline