Metody badania antybiotykooporności

►

Oznaczanie wrażliwości na leki jest

jednym z najważniejszych etapów

rutynowej diagnostyki

mikrobiologicznej zakażeń

bakteryjnych.

►

Mikrobiolog:



konsultacja medyczna



interpretacja wyniku mikrobiologicznego

Ilość badań mikrobiologicznych wg

WHO

►

100 badań na jedno łóżko szpitalne

►

dla pacjentów ambulatoryjnych jedno

badanie mikrobiologiczne na 16 osób

populacji

►

Polska – 5 – 40% tych norm

►

Zasady doboru testów

(do oznaczania

wrażliwości bakterii na antybiotyki i

chemioterapeutyki) w rutynowej diagnostyce

mikrobiologicznej zawarte są w

rekomendacjach

opracowanych w

Krajowym Ośrodku

Referencyjnym ds. Lekowrażliwości

Drobnoustrojów

powołanym decyzją Ministra

Zdrowia i Opieki Społecznej w 1997 roku.

►

Podstawą metodyczną rekomendacji

w zakresie

wykonania, interpretacji i standaryzacji

oznaczania lekowrażliwości jest

norma

National Committee for Clinical Laboratory

Standards (NCCLS).

STANDARYZACJA !!!!!!

Standaryzacji podlega m. in:

►

skład podłoża (najczęściej agar Mueller-

Hintona bez lub z dodatkiem Isovilatexu lub

4% NaCL

►

inokulum (0,5 stopnia wzorca skali Mc

Farlanda)

►

warunki i czas inkubacji

►

interpretacja wyników (np.: interpretacja na

podstawie wielkości stref zahamowania

wzrostu szczepu wokół krążków w mm zgodna

z instrukcją dołączoną do krążków)

Wrażliwość

►

mikrobiologiczna

– oznacza, że dany

szczep należy do wrażliwej populacji i

nie posiada mechanizmów oporności, a

sukces kliniczny w takiej sytuacji jest

wysoce prawdopodobny,

►

kliniczna

– oznacza skuteczność

kliniczną przy zastosowaniu

standardowych dawek leku, (wpływ

innych czynników takich jak:

właściwości farmakokinetyczne i

farmakodynamiczne leku, stan

odporności pacjenta)

Średnia wrażliwość

►

dotyczy grupy szczepów, które znajdują się

pomiędzy mikrobiologicznie wrażliwymi i

mikrobiologicznie opornymi. Sukces

kliniczny jest trudny do przewidzenia, ale

może być osiągnięty:



zastosowanie antybiotyku w wyższej dawce



zwiększenie częstotliwości podawania leku



jeśli antybiotyk ulega zagęszczenie w miejscu

zakażenia, osiągając wysokie stężenia



Konieczność potwierdzenia oznaczeniem MIC.

MIC oznaczony !!!

Oporność

►

mikrobiologiczna

– szczep posiada

mechanizm oporności, (oporność niskiego lub

wysokiego stopnia)

►

farmakokinetyczna

– bakterie mogą przeżyć

w obecności antybiotyku w stężeniu wyższym

niż jest możliwy do osiągnięcia

in vivo

miejscu zakażenia,

►

kliniczna

– sukces terapeutyczny jest

niemożliwy do osiągnięcia, pomimo

zastosowania maksymalnych dawek

antybiotyku.

Oporność naturalna

►

stała cecha gatunku, rodzaju, rodziny

drobnoustrojów; również oporność występująca

u znacznej części populacji (



-laktamazy u

Staphylococcus sp., Moraxella catarrhalis

)

!!!!

Oporność naturalna może wynikać:



z braku w komórce miejsca docelowego/niskiego

powinowactwa



z braku lub niskiej penetracji/transportu antybiotyku

przez ścianę komórkową



z wytwarzania enzymu inaktywującego antybiotyk

Oporność nabyta

jeżeli nie stanowi naturalnej cechy

szczepów danego gatunku drobnoustroju,

wynika z presji selekcyjnej, związanej z

powszechnym stosowaniem antybiotyków

(nie tylko do celów terapeutycznych).

Oporność

krzyżowa

niewrażliwość na wszystkie lub niektóre antybiotyki
należące do tej samej grupy chemicznej (np.: -laktamy,

aminoglikozydy, makrolidy) lub niespokrewnionej grupy
chemicznej, gdy miejsca uchwytu dla antybiotyków
znajdują się blisko siebie (np.: makrolidy i linkozamidy).

Tolerancja

►

brak aktywacji enzymów autolitycznych

przez antybiotyk



-laktamowy i spadek

lub brak jego działania bakteriobójczego

bez utraty działania hamującego;

►

MBC/MIC



32.

►

np. niektóre szczepy

S.pneumoniae

„tolerują” penicylinę do czasu, gdy jej

działanie jest tylko bakteriostatyczne.

Inokulum

liczba komórek bakteryjnych w

podłożu płynnym, wyrażana jako liczba

jednostek tworzących kolonie na

mililitr (

colony-forming units

per

mililitre

– CFU/ml) = zmętnienie,

gęstość optyczna zawiesiny

bakteryjnej.

Efekt inokulum !!!!

Stężenie graniczne

(

breakpoint

)

określona wartość MIC lub określona wielkość

strefy zahamowania wzrostu, będąca

podstawą do zakwalifikowania danego szczepu

do jednej z trzech kategorii klinicznych:



S (sensitive) wrażliwy – wartość MIC jest równa lub

niższa od stężenia antybiotyku osiąganego w

surowicy przy normalnym dawkowaniu leku



I (intermediate) średniowrażliwy – w leczeniu może

być użyty przez zwiększenie jednorazowych dawek

leku



R (resistant) oporny – wartość MIC będzie wyższa od

stężenia leku osiągniętego w surowicy.

►

MBC

(minimal bactericidal activity

concentration)

najmniejsze stężenie

bakteriobójcze, jest miarą aktywności

bakteriobójczej antybiotyku.

►

MIC

(minimal inhibitory concentration)

najmniejsze stężenie hamujące, jest miarą

zdolności antybiotyku do zahamowania

wzrostu bakterii.

Znakomitą aktywność bakteriobójczą wykazują
te preparaty, dla których wartość MBC jest
równa lub bliska wartości MIC.

Czynniki wpływające na

aktywność

przeciwbakteryjną



pH środowiska

(niektóre leki są bardziej aktywne w pH

kwaśnym (np. nitrofurantoina) a inne w pH zasadowym (np.

aminoglikozydy, sulfonamidy)),



skład podłoża

(np. detergenty hamuja aktywność

aminoglikozydów),



trwałość leku

(liczne leki tracą aktywność w temp. inkubacji (np.

chlorotetracyklina)), inne są trwałe przez długi okres czasu (np.

aminoglikozydy, chloramfenikol),



wielkość inokulum

(im większe inokulum, tym mniejsza

wrażliwość bakterii),



czas inkubacji

(często podczas krótkiego działania leku bakterie

nie są zabijane, a tylko hamowany jest ich wzrost. Im dłuższy

czas inkubacji, tym większe prawdopodobieństwo pojawienia się

mutantów opornych, gdy działanie antybiotyku jest słabsze),



aktywność metaboliczna drobnoustrojów

(na ogół aktywne i

szybko rosnące organizmy są wrażliwsze na działanie leku od

tych, które znajdują się w fazie spoczynkowej).

Jakościowe

•metoda krążkowo-dyfuzyjna

 m. seryjnych rozcieńczeń

w podłożu stałym lub

płynnym (MIC, MBC)

•metody skriningowe
ocena wrażliwości gronkowców na metycylinę

 E – testy (met.

dyfuzyjna)
ocena wrażliwości enterokoków na wankomycynę,
wysokie stężenia aminoglikozydów

•metody specjalne (dla bakterii trudno hodowlanych
m. in. Mycobacterium, Haemophilus, Mycoplasma)

Ilościowe

Metoda krążkowo -

dyfuzyjna



powszechnie stosowana,

łatwa do wykonania,



standaryzowana (dwie

odmiany: wg ICS i wg NCCLS),



umożliwia oznaczenie

wrażliwości badanego

szczepu na kilka

antybiotyków jednocześnie,



krążki nasycone

antybiotykami w stężeniu

takim jakie osiągane jest w

surowicy,



odczytanie wyników i ich

interpretacja na podstawie

wielkości stref zahamowania

wzrostu szczepu wokół

krążków (zgodnie z instrukcją

dołączoną do krażków).

Metody skriningowe



do wykrywania gronkowców opornych na

metycylinę (MRSA, MRCNS),



do oceny wrażliwości enterokoków na

wankomycynę, wysokiego poziomu

oporności na gentamycynę i oporności na

streptomycynę.

Metody rozcieńczeniowe w

podłożu stałym lub płynnym



metody określające MIC, umożliwiają też

określenie wartości MBC (w tym celu

należy wykonać przesiew z hodowli

płynnej na podłoże stałe z probówki ze

stężeniem antybiotyku poniżej MIC i

czterech kolejnych w kierunku

wzrastającego stężenia),



metody półilosciowe (automatyczne lub

półautomatyczne) np.: ATB ANA, ATB

FUNGUS.

E – test



metoda dyfuzyjna,

pozwalająca określić

wartość MIC,



oparta na dyfuzji

antybiotyku

zawartego w pasku

bibułowym w

gradiencie stężeń do

podłoża, na którym

wzrasta badany

szczep.

Document Outline