CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA W DIAGNOSTYCE HEMATOLOGICZNEJ

Cytometria przepływowa

w diagnostyce

laboratoryjnej płynów z

jam ciała

OML, 2008

Mirosława

Pietruczuk

Cytometria

przepływowa

Pozwala na

szybką,

wieloparametrową

analizę

zawiesiny komórek.

Slide 46 of 81

Cytometria przepływowa

Warunkiem wykonania badania jest

doprowadzenie posiadanego materiału

zawiesiny

pojedynczych

komórek:

szpik kostny

pobierany jest

na heparynę

krew obwodowa

pobierana

jest

wersenian

dwupotasowy
(procedura dla krwi pełnej)

węzły

chłonne

–

homogenizacja

płyny

jam

ciała

–

antykoagulant,

jeżeli jest potrzeba

Cytometria

przepływowa

Pozwala na ocenę fenotypu komórek

pobranych

ze źródła wtórnego

np. płynu

opłucnowego,

otrzewnowego,

towarzyszącego guzom, w sytuacjach

kiedy

nie

można

pobrać

materiału

pierwotnego.

Pobrany materiał

musi być dostarczony w odpowiednim czasie
i warunkach:

węzeł chłonny

- zawieszony w jałowym

obojętnym płynie, np. soli fizjologicznej, czas
transportu < 2h

szpik kostny

- umieszczony w chłodzonym

pojemniku
czas opracowania nie dłuższy niż kilka godzin

płyny z jam ciała

czas opracowania nie dłuższy niż kilka godzin

W uzyskanej

zawiesinie

komórkowej

ocenia się

żywotność komórek

(niska np. 60% powoduje
nieswoiste wiązanie przeciwciał).

UWAGA:



liza krwinek czerwonych (powoduje uszkodzenie

części wrażliwych komórek blastycznych)



wirowanie w gradiencie gęstości (powoduje

utratę pewnych populacji komórek) i może

przyczyniać się do błędnej oceny proporcji

populacji komórek.

Przeciwciała monoklonalne

(MoAb)

Przeciwciała monoklonalne
skierowane są na

antygeny

różnicowania CD
(cluster of differentiation),

obecne:

na powierzchni

i/lub

w cytoplazmie

i/lub

w jądrze komórek

Metody wykorzystujące

MoAb

w diagnostyce:



immunofluorescencja



mikroskop fluorescencyjny

(promieniowanie ultrafioletowe )



cytometria:

cytometry
sortery ( światło laserowe)



immunocytochemia



metody immunoenzyma
tyczne:



APAAP, POX

Ocena fenotyp

czyli

ekspresji determinant powierzchniowych

oraz struktur cytoplazmatycznych komórek,
jąder komórkowych

przy użyciu przeciwciał

monoklonalnych pozwala na określenie
stopnia dojrzałości i zróżnicowania komórek.

Ekspresja determinant

Na powierzchni komórek jest bardzo różna
od

silnej

np. HLA-DR, CD19, po

słabą

np.

CD7.

Najczęściej przyjmuje się, że komórki
badane

wykazują

ekspresję

danej

determinanty wtedy,

jeżeli minimum

20%

komórek

wykazuje

intensywność

fluorescencji wyższą niż tło.

Cytometria przepływowa w

różnicowej

diagnostyce białaczek

ostrych.

1976r - klasyfikacja FAB
(Mo - M6, L1 - L3)

1985r –
uzupełnienie

klasyfkacji

FAB (M7, M5a,

M5b)

indukcja
remisji

intensyfkacja

leczenie

podtrzymujące
i reindukcyjne

~ 10

blastów

< 10

blastów

-1

blastów

~ 10

blastów

~1
kg

Białaczka
pełnoobjawowa

~1 g

~1
mg

Remisja
labolatoryjna
i kliniczna

Skuteczność
kontroli
immunologiczne
j

90 % prawdopodo-
bieństwa
wyleczenia

Podstawą współczesnego rozpoznawania

ostrych białaczek jest kompleksowa ocena



morfologiczno-cytochemiczna



immunologiczna



cytogenetyczna

klonu białaczkowego

(populacji komórek

wywodzących się z klonu

białaczkowego).

Analiza fenotypów

komórek patologicznych posiada znaczenie

nie tylko w okresie diagnostycznym a także w

jego trakcie jak i we wznowach.
Obecnie

duży

nacisk

kładzie

się

poszukiwanie choroby resztkowej

(minimal

residual disease)

w oparciu o nietypowe

fenotypy komórek patologicznych,
oznaczane metodą
cytometrii przepływowej.

Badania fenotypu

komórek

Powinno być wykonane równolegle
do oceny hematologicznej rozmazu
i mielogramu czy też histologicznej
węzła chłonnego lub bioptatu guza.

Panele



(

standardowe lub zestawione samodzielnie

zestawy

przeciwciał

monoklonalnych)

pozwalają na :



określenie z jakiej linii komórkowej pochodzi

badana komórka,



jaki

jest

jej

stopień

dojrzałości

zróżnicowania,



jakim

stopniu

jej

fenotyp

jest

odpowiednikiem

fenotypu

prawidłowej

komórki

szpiku

czy

węzła

chłonnego

znajdującej się na takim samym etapie

dojrzewania i zróżnicowania.

Cytometria przepływowa

w diagnostyce chłoniaków.

Cytometria przepływowa została

wykorzystana do opracowania
nowej klasyfikacji chłoniaków
nieziarniczych

(REAL i WHO).

Klasyfikacja  REAL  i  WHO  ma  na
celu  powiązanie  rozpoznania  z
obrazem  klinicznym,  sposobem
leczenia i rokowaniem.

Badanie

fenotypu

komórkowego

Powinno być wykonane

równolegle do oceny
histologicznej węzła
chłonnego lub bioptatu
guza. Określenie fenotypu komórek
chłoniaka

niaziarniczego

wymaga

zestawu innych niż w białaczkach
ostrych, przeciwciał monoklonalnych

Typ zwykły PBL:

Przewlekła

białaczka

limfocytowa

B - komórkowa

Hiperleukocytoza

Limfocytoza -

>4.0x10

we krwi obwodowej

Różnego stopnia

pancytopenia:

(leukopenia

erytrocytopenia

trombocytopenia)

Diagnostyka CLL

W oparciu o kryteria IWCLL i NCI
-Working Group Guidelines:
1) liczba limfocytów we krwi obwodowej
> 5.0x 10

/l i podstawowy fenotyp

CD19+, CD5+, CD23+, FMC-7 minus.

„pre CLL” –

obecność
monoklonalnej
limfocytozy
<5,0x10

Cytometria

przepływowa

w diagnostyce

przewlekłej

białaczki

szpikowej

Pozwala

także

ocenę

fenotypu

komórkowego

kryzie

blastycznej

przewlekłej białaczki szpikowej, w której
u

20-30% chorych występuje przełom

limfoblastyczny

(najczęściej

cIg

(cytoplazmatyczną Ig) lub

antygenem

Calla, najrzadziej z markerami linii T).

Zespoły

mielodysplastyczne (MDS)

i cytometria przepływowa

Zespoły mielodysplastyczne stanowią duży

problem kliniczno-diagnostyczny.
Cytometria

przepływowa

MDS

wykorzystywana jest przede wszystkim

poszukiwania komórek o nieprawidłowym

fenotypie

(np. jednoczesna ekspresja
CD2 i CD19)

i do wychwycenia
transformacji
w ostrą białaczkę.

MDS

Należy

jednak

podkreślić,

że

różnorodność zaburzeń

w obrębie wielu

linii komórkowych w MDS, utrudnia
ujednolicenie kryteriów rozpoznawczych
w oparciu o fenotyp komórkowy.

Poszukiwanie choroby

resztkowej (

MRD

)

- minimal

residual disease

Bardzo często w celu wykrycia MRD łączy

się ocenę fenotypu komórek z analizą

DNA. Takim przykładem mogą być

białaczki

ALL

(ostre

białaczki

limfoblastyczne)

obecnością

aneuploidalnych blastów.

Różnicuje

się

komórkami

diploidalnymi po chemioterapii.

Zaleca

się wtedy oznaczenie antygenów CD34,

CD10, CD19 z jednoczesną analizą

cytometryczną DNA.

Nietypowy fenotyp

pojawienie się na powierzchni komórki

dodatkowych

determinant,

których

nie

posiada

odpowiadająca

jej

komórka

prawidłowa z danej linii i na tym samym

etapie dojrzewania i
różnicowania
np. białaczka limfoblastyczna typu common:

CD10

/CD19, CD22, CD20, HLA-DR

lub brak ekspresji determinat, która znajduje

się na prawidłowych komórkach
np. białaczka limfoblastyczna T komórkowa:

CD2, CD5, cyt.CD3, CD8, TdT i

brak sCD3,

TCR.

Ocena obecności

molekuły

lekooporności

Oporność wielolekowa (MDR – multi
drug

resistance)

powoduje

niewrażliwość komórek nowotworowych
na

chemioterapię.

Jednym

mechanizmów  odpowiedzialnych  za  ten
fenomen  jest  redukcja  akumulacji  leku
wewnątrz  komórki  w  zależności  od
aktywności

transbłonowego

białka

transportowego.

Ocena obecności

molekuły

lekooporności

Białko  to  jest  produktem  genu
mdr1  zwanym  P-glikoproteiną  (P-
gp)  (6).  P-gp  działa  jako  ATP-
zależna

pompa,

powodująca

wypływ

leków

czy

toksyn

komórki.

W szpiku kostnym P-gp

jest wykrywana na komórkach
CD34+ (komórki hemopoetyczne
stem).

MDR

Do oceny oporności

wielolekowej stosuje się
czynnościową analizę
cytometryczną wypływu
znakowanego

fikoerytryną R123

lub przeciwciała
monoklonalne

znakowane

fikoerytryną, skierowane
przeciwko
Zewnątrzkomórkowemu
epitopowi P-gp.

Cytometria przepływowa w

różnicowej diagnostyce

laboratoryjnej -

przyszłość

Ocena procesu

apoptozy

zastosowanie

prognozowania odpowiedzi
na

leczenie

terapii

celowanej.

(ocena

indeksu

apoptotycznego,

białek

rodziny Bcl-2,
kaspaz, kinaz,
potencjału
mitochondrialnego).

Ilościowa cytometria przepływowa

w klinicznej diagnostyce

laboratoryjnej

QFCM – quantitative flow cytometry

Ilościowa cytometria przepływowa

wymaga

dodatkowo

standaryzacji.

Konwencjonalne immunofenotypowanie

pozwala

zmierzyć efekt łączenia Ab z

MoAb

proporcjonalne do ich ilości.

Kliniczne zastosowanie

QFCM



Choroby rozrostowe:

wykorzystanie aberrantnej ekspresji

antygenówna

komórkach

nowotworowych



Przykłady:



CD20

w CLL



„Bright” ekspresja CD20 w HCL



Obniżenie ekspresji

CD3

w Mucosis

fungoides



CD5 –

„dim” w LGL

Kliniczne zastosowanie

QFCM

Bcl-2

Ilościowe oznaczenie ekspresji
białka Bcl-2 ma szczególne
znaczenie
w

leczeniu

antysensami

olgonukletydowymi. Stosuje się
je w:



ALL (B komórkowej)



AML (M1, M2)

Kliniczne zastosowanie

QFCM



Ilościowe

oznaczenie

gęstości receptorów dla
estrogenu

lub

progesteronu w leczeniu
raka piersi

Kliniczne zastosowanie

QFCM



MRD (Minimal residual

disease):



Pozwala na wykrycie

populacji komórek
nowotworowych w ilości
< 1%.

Kliniczne zastosowanie

QFCM

Przeciwciała monoklonalne w terapii



za pomocą immunotoksyn:



Rituximab,

(

antyCD20

)

chłoniakch B komórkowych



Herceptin,

(Trastuzumab,

anty

EGFR

(HER2, 1,2) w raku piersi

HER2+



Avastin, (

anty VGFR

) w raku jelita

grubego

Kliniczne zastosowanie

QFCM



ONTAK, (

anty IL-2R

), w

leczeniu

chłoniaków

komórkowych



Campath,

(Alemtuzumab,

antyCD52

), w białaczkach i

chłoniakach

Kliniczne zastosowanie

QFCM



Prognozowanie zachorowania na AIDS

(ocena aktywności wirusów HIV)



Ilościowa ocena ekspresji

antygenu

CD38 na limfocytach CD8+

pozwala na

przybliżone

określenie

czasu

wystąpienia klinicznych objawów AIDS.



Rodzinna Hypercholesterolemia



Ilościowa ocena ekspresji receptora

LDL

Kliniczne zastosowanie

QFCM



Sepsa:



- ilościowa ocena ekspresji

antygenu

CD69

na aktywnych leukocytach



- ilościowe obniżenie ekspresji CD14
na monocytach i CD64 i CD11b na
neutrofilach



Rheumatoid arthritis:



HLA-DR4



Kliniczne zastosowanie

QFCM



Choroby genetyczne:



Zespół leniwych leukocytów -

ilościowa ocena ekspresji

cząstek CD11/CD18



Transplantacja: ocena

choroby GVHD

Document Outline