Metody
wykrywania
mutacji

Izolacja DNA



Izolacja DNA polega na oddzieleniu

DNA od innych struktur komórkowych

oraz od cząsteczek RNA i białek

związanych z DNA.

Istnieje kilka metod izolacji DNA. O ich

wyborze decyduje rodzaj materiału

biologicznego oraz przeznaczenie

uzyskanego DNA.

Izolacja DNA - etapy



Liza komórek



Denaturacja i hydroliza białek



Usunięcie białek



Zagęszczenie DNA

Izolacja RNA - metody



Izolacja specyficznego RNA w wyniku

frakcjonowania całkowitego RNA

komórki



Bezpośrednia izolacja specyficznego

RNA ograniczona do kom syntezujących

dany RNA w zwiększonej ilości



Izolacja poli(A)RNA



Izolacja RNA z polirybosomów



Izolacja całkowitego RNA komórki, a

następnie uzyskanie określonego RNA w

formie DNA w procesie odwrotnej

transkrypcji

Izolacja RNA - różnice



RNA jest bardziej narażony na
degradację niż DNA



Konieczność usunięcia DNA podczas
izolacji



rRNA, tRNA oraz RNA
niskocząsteczkowy w komórkach
eukariotycznych stanowią łącznie ok.
80-98% RNA

Elektroforeza



Elektroforeza preparatywna –
umożliwia izolację z żelu tej części
preparatu, która jest niezbędna do
dalszych prac



Elektroforeza analityczna – służy do
charakterystyki badanego preparatu



Elektroforeza kapilarna – stosowana
podczas analizy DNA celem ustalenia
sekwencji pojedynczego łańcucha DNA

DGGE/TGGE – elektroforeza na
żelach z gradientem
czynnika
denaturującego/temperatury

Metoda polega na elektroforezie

dwuniciowego DNA w żelu o

wzrastającym stężeniu czynnika

denaturującego. Pod wpływem

denaturacji fragmenty DNA ulegają

dysocjacji na pojedyncze nici. W

momencie rozdzielenia na pojedyncze

nici przemieszczanie DNA w żelu zostaje

gwałtownie przyhamowane. Moment

denaturacji DNA zmutowanego jest inny

niż DNA prawidłowego.

SSCP – single strand
conformation
polymorphism

Metoda służąca do

badania polimorfizmu

konformacyjnego

jednoniciowych

cząsteczek DNA, czyli

różnic powstałych w

wyniku tworzenia

odmiennych struktur

trójwymiarowych przez

jednoniciowe cząsteczki

DNA, normalne i

zmutowane tego

samego fragmentu

łańcucha

polinukleotydowego –

dzięki wykorzystaniu

elektroforezy.

Techniki hybrydyzacyjne
analizy kwasów
nukleinowych

Hybrydyzacja – tworzenie podwójnej
helisy między komplementarnymi
nićmi DNA lub RNA pochodzących z
różnych źródeł

Sondy molekularne i
znakowanie

SONDY



Fragmenty

jednoniciowego DNA

i RNA poszukiwanego

genu sklonowanego

wcześniej



Syntetyczny

oligonukleotyd o

sekwencji

komplementarnej do

odcinka DNA



Sonda utworzona

dzięki amplifikacji

metodą PCR

ZNAKOWANIE



Radioaktywne



Nieradioaktywne (np

metodami

fluorescencyjnymi)



Immunochemiczne,

cytochemiczne



enzymatyczne

Metoda Southerna –
Southern blot



Umożliwia
zidentyfikowanie
fragmentów
restrykcyjnych
poprzez użycie
elektroforezy
oraz sond
molekularnych

Metoda Southerna –
zastosowanie i
ograniczenia



Metoda b. często stosowana w
diagnostyce DNA, użyteczna w
wykrywaniu mutacji punktowych



Konieczna jest znaczna ilość DNA



Wynik można uzyskać po 7-14 dniach



Ekspozycja na znaczniki radioaktywne

Hybrydyzacja typu
northern

Wykorzystywana do analizy RNA i

procesu transkrypcji poszczególnych
genów. Dzięki niej można ustalić, które
geny ulegają transkrypcji w badanych
tkankach lub na danym etapie rozwoju
organizmu. Ponadto umożliwia
poznanie długości RNA badanych
genów a także intensywność, z jaką są
one transkrybowane w różnych
układach biologicznych.

Hybrydyzacja typu
western

Rozdziela zdenaturowane białka według

ich mas oraz niezdenaturowane według

ich struktury przestrzennej, za pomocą

elektroforezy w żelu

poliakrylamidowym. Później białka są

przenoszone na membranę (zwykle

nitrocelulozową). Obecność

odpowiednich białek jest sprawdzana za

pomocą barwników takich jak Ponceau

S, czerń amidowa czy Coomassie

Brilliant Blue lub za pomocą przeciwciał

przyłączających się do ich epitopów.

RFLP - Restriction
Fragments Length
Polymorphism

Tą techniką wykrywa się różnice
pomiędzy rozmiarami fragmentów
DNA pociętych restryktazami. Różnice
długości fragmentów DNA powstają w
wyniku mutacji, które tworzą lub
eliminują miejsca rozpoznawane przez
te enzymy. Sekwencje polimorficzne
RFLP, które wykrywa się tą metodą, są
używane jako znaczniki zarówno w
mapach fizycznych jak i genetycznych.

ASO - Hybrydyzacja
Oligonukleotydu
Specyficznego względem
allelu

Stosuje się sondy molekularne – jedną

komplementarną do sekwencji

prawidłowej, drugą do zmutowanej.

pomiędzy sondą a badanym DNA

dochodzi do hybrydyzacji. Obecność

sygnału po hybrydyzacji z sondą

komplementarną do sekwencji

prawidłowej oznacza brak mutacji, sygnał

otrzymany po hybrydyzacji z sondą

komplementarną do odcinka

zmutowanego oznacza obecność mutacji.

Hybrydyzacja z użyciem
mikromacierzy

Naniesienie na odpowiedni nośnik w sposób

zaplanowany i uporządkowany licznych

wzorcowych sekwencji, będących

podłożem do hybrydyzacji materiału

badanego.



Analiza transkryptominczna (RNA)



Badanie DNA



Badanie sekwencji genów



Analiza jednonukleotydowych

polimorfizmów DNA typu SNP



Badanie oddziaływań DNA z białkami

Analiza heterodupleksów

Polega na wychwyceniu powstającego w

wyniku mutacji braku parowania
pomiędzy pojedynczymi nukleotydami
w komplementarnych (dwuniciowych)
fragmentach kwasów nukleinowych.
Struktury wytwarzane w zależności od
typu mutacji: „pęcherzyki”
(substytucje), zgięcia nici DNA,
wybrzuszenia jednostronne (insercje
lub delecje).

FISH- fluorescent in situ
hybridization

Stosuje się fluorescencyjnie

wyznakowane sondy DNA,

metoda ta pozwala na

wykrycie mutacji i jej

lokalizację.

Można stosować

jednocześnie wiele sond

wyznakowanych różnymi

związkami

fluorescencyjnymi.

Zastosowanie do

wykrywania aneuploidów,

mikrodelecji, duplikacji,

utraty heterozygotyczności

(nowotwory).

Enzymatyczna - metoda
Sangera

Na jednoniciowej matrycy syntetyzuje się in

vitro DNA. Synteza przebiega od

radioaktywnego, oligonukleotydowego startera

komplementarnego do 3` końca matrycy.

Reakcję wykonuje się równolegle w czterech

probówkach, w których oprócz kompletu

deoksytrifosforanów nukleotydów (dATP , dCTP ,

dTTP , dGTP) dodana jest niewielka ilość jednego

z nich w postaci dideoksytrifosforanu

nukleotydu, co uniemożliwia kontynuowanie

reakcji w momencie włączenia takiego

nukleotydu w syntetyzowany łańcuch, ponieważ

brakuje wtedy grupy hydroksylowej na 3` koncu.

Chemiczna - metoda
Maxama-Gilberta

Polega na degradacji wyznakowanych na 5` końcu

cząsteczek DNA związkami chemicznymi

przecinającymi specyficznie wiązania

fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadającym

określonej zasadzie azotowej. Wynikiem reakcji jest

zbiór fragmentów DNA o różnej długości co

spowodowane jest takim doborem warunków , że w

poszczególnych cząsteczkach przecinane jest tylko

jedno lub dwa wiązania. Fragmenty z czterech

niezależnych reakcji rozdziela się elektroforetycznie

po czym poddaje autoradiografii. Prążki na

autoradiogramie odpowiadają fragmentom DNA

posiadającym na końcu 5` znakowany fosfor a na

końcu 3` określoną zasadę