Oznaczanie kariotypu

Zakład Genetyki Medycznej 
UM w Łodzi

mgr  E. Zając

Etapy badania 

cytogenetycznego

• Namnożenie komórek w hodowli in vitro w celu uzyskania 

komórek dzielących się mitotycznie

• Nagromadzenie komórek w stadium metafazy uzyskane 

poprzez inkubację z kolchicyną

• Zakończenie hodowli i sporządzenie preparatów 

chromosomowych

     szok hipotoniczny
     utrwalenie komórek
     naniesienie zawiesiny komórek na szkiełko podstawowe
• Wybarwienie chromosomów metoda prążkową
• Analiza chromosomów w mikroskopie przy powiększeniu 1000 x
• Sporządzenie dokumentacji obrazu chromosomów – kariogramu
• Wypisanie wyniku badania

• Zastosowanie technik cytogenetyki molekularnej w 

uzasadnionych przypadkach.

Standardowa hodowla limfocytów

G

0

G

1

G

2

wykończenie hodowli

M

S

stymulacja limfocytów 
do wzrostu

Colcemid

PHA

Analiza cytogenetyczna:

Wymagania konieczne do 

prowadzenia hodowli 

cytogenetycznej

•Podłoże hodowlane odpowiednie dla rodzaju 

hodowanej    tkanki 

•Jałowe naczynie w którym przebiega hodowla

•Inkubator ustawiony do temperatury 37 st.C z 

automatycznym przepływem dwutlenku węgla ( 5 

% CO2 )

 Do momentu wykończenia każda hodowla 

cytogenetyczna przebiega w warunkach jałowych

Rodzaje tkanek w których 
oznacza się kariotyp

• Diagnostyka postnatalna:

– limfocyty krwi obwodowej (3-5 ml)
– fibroblasty skóry (biopsja skóry)

• Diagnostyka prenatalna:

– komórki owodniowe (zależnie od hbd)
– komórki trofoblastu
– komórki popłodu

• Diagnostyka nowotworowa:

– szpik
– komórki nowotworowe

  Sposób pozyskiwania materiału

• limfocyty krwi obwodowej

   2 ml pełnej krwi pobranej na heparynę w celu uniknięcia skrzepu w 

proporcji 0,1 ml heparyny / 1 ml krwi

• komórki płodu    

   zawiesina komórek uzyskana po odwirowaniu wód płodowych 

pobranych  w czasie zabiegu amniopunkcji 

• komórki trofoblastu

   fragment trofoblastu uzyskany na drodze biopsji

• fibroblasty skóry

   niewielki fragment skóry właściwej pobranej przy użyciu odpowiednich 

narzędzi ( skin biopsy punches )

• fibroblasty gonad

   materiał pobrany śródoperacyjnie

• fibroblasty popłodu

   niewielki fragment tkanki popłodu pobrany w czasie sekcji

• szpik

   biopsja szpiku (~1 ml) 

• komórki nowotworowe 

   fragment guza litego

Założenie, przebieg i 

wykończenie hodowli

Postnatalne badania cytogenetyczne

• Limfocyty krwi obwodowej

 

   w probówce do hodowli limfocytów umieszczamy 9 ml kompletnego 

podłoża Karyotyping, 0,5 ml mitogeu – LF-7 i 0,8 ml pełnej krwi 

   inkubujemy w cieplarce przez 72 h ( raz w ciągu dnia dokładnie 

mieszamy )

   po 48 h wymieniamy podłoże na świeże bez mitogenu
   po upływie 72 h wykańczamy hodowlę poprzez dodanie Colcemidu, 

zastosowanie

   szoku hipotonicznego przy użyciu 0,075 M KCL i utrwalenie w 

mieszaninie metanolu i kwasu octowego w stosunku 3:1

   wykonujemy preparaty poprzez nakraplanie utrwalonej zawiesiny 

na przygotowane szkiełka podstawowe

Założenie, przebieg i 

wykończenie hodowli

Postnatalne badania cytogenetyczne

• Fibroblasty skóry, gonad, popłodu, komórki nowotworowe

   

fragment skóry właściwej inkubujemy w probówce w roztworze 

Kolagenazy Typ IV w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek

   zawiesinę komórkową przenosimy do naczynia ‘’ typu Falcon ‘’ i 

dodajemy 6 ml kompletnego podłoża BioAmf-2

   po upływie 5 – 7 dni po raz pierwszy obserwujemy hodowlę w 

mikroskopie odwróconym, w przypadku uzyskania wzrostu komórek 

wymieniamy podłoże co

   2 -3  dni
   w momencie uzyskania wzrostu komórkowego na całej powierzchni 

naczynia wykonujemy pierwszy pasaż, czyli podział i przeniesienie 

hodowanego materiału do kolejnych naczyń

   wykańczamy hodowlę gdy obserwujemy odpowiedni wzrost i 

odpowiednią liczbę figur podziałowych w jednym z naczyń poprzez 

dodanie Colcemidu, zastosowanie szoku hipotonicznego przy użyciu 0,4 

% chlorku potasu i cytrynianu sodu, utrwalenie w mieszaninie metanolu 

i kwasu octowego w stosunku 3:1

   wykonujemy preparaty poprzez nakraplanie utrwalonej zawiesiny na 

przygotowane szkiełka podstawowe

Założenie, przebieg i 

wykończenie hodowli

Prenatalne badania cytogenetyczne

•Komórki płodu - hodowla in situ

 

  

uzyskane wody płodowe wirujemy, supernatant przekazujemy do 

badania biochemicznego, osad komórkowy zawieszamy w 0,5 ml  

kompletnego podłoża BioAmf-2
nanosimy zawiesinę komórkową równomiernie na cztery szkiełka 

nakrywkowe umieszczone w jałowych szalkach Petriego
po 24 h dodajemy 2 ml podłża, które następnie wymieniamy co 2 dni
wykańczamy hodowlę gdy obserwujemy odpowiedni wzrost komórek 

i odpowiednią liczbę figur podziałowych w szalkach poprzez dodanie 

Colcemidu, zastosowanie szoku hipotonicznego przy użyciu 0,8 % 

cytrynianu sodu, utrwalenie w mieszaninie metanolu i kwasu 

octowego w stosunku 3:1 oraz 2:3
preparatami są szkiełka nakrywkowe z utrwalonymi koloniami 

amniocytów

Założenie, przebieg i 

wykończenie hodowli

Prenatalne badania cytogenetyczne

• Komórki trofoblastu – hodowla bezpośrednia

 

   

uzyskane kosmki trofoblastu umieszczamy w szalce Petriego z 

2ml podłoża BioAmf-2

   po 72 h wykańczamy hodowlę poprzez dodanie Colcemidu, 

zastosowanie szoku hipotonicznego przy użyciu 0,8 % 
cytrynianu sodu, utrwalenie w mieszaninie metanolu i kwasu 
octowego w stosunku 3:1 

   

wykonujemy preparaty poprzez nakroplenie i rozprowadzenie  

utrwalonej zawiesiny komórkowej na przygotowanych szkiełkach 
podstawowych

Czas trwania hodowli

•Limfocyty krwi obwodowej – 72 godziny
•Fibroblasty skóry i inne – 2 do 3 tygodni
•Komórki płodu po hodowli in situ – 7 do 10 dni
•Komórki trofoblastu po hodowli bezpośredniej – 

3 dni

Barwienie preparatów

Preparaty uzyskane po hodowli 

cytogenetycznej barwimy 

rutynowo techniką 

prążków G  ( GTG )

W przypadku stwierdzenia nieprawidłowości 

wzoru prążków G wymagane jest 

zastosowanie innych technik prążkowych :
•Technika prążków C ( CBG )
•Technika prążków Q ( QFQ )
•Technika prążków NOR
•Technika prążków DAPI

Technika prążków G (GTG)

  Charakterystyczny wzór prążkowy dla każdego 

chromosomu – na przemian jasne i ciemne 
poprzeczne prążki.

Technika prążków GTG

46 chromosomów 
22 autosomy
2 gonosomy 

23 chromosomy od matki
23 chromosomy od ojca

Numerowanie 
prążków

centromer -> telomer

p = 

krótkie ramię

q = 

długie ramię

Ideogramy

Chromosomy:

• metacentryczne (pq)

• akrocentryczne (p<<q)

• submetacentryczne (p<q)

Technika GTG – prawidłowy karityp 
męski, prawidłowy kariotyp żeński 

telomery

telomery

Prążki 

G-pozytywne

AT

nieliczne geny

P

q

Prążki 

G-negatywne

GC

głównie geny

centromer

Technika GTG

Technika prążków Q (QFQ)

  Podobny do G wzór prążkowy uzyskany po barwieniu 

quinakryną (barwnik fluorescencyjny). Intensywnie 
zabarwia się dystalna część ramienia długiego chr.Y

Technika prążków C (CBG) 

  W postaci ciemnych prążków barwią się centromery  wszystkich 

chromosomów i heterochromotyna konstytutywna w 
chromosomach 1, 9, 16, i Y.

Technika barwienia DAPI

  Wybarwia się heterochromatyna okołocentromerowa 

chromosomów 1, 9, 16, dystalna część ramienia 

  długiego Y, ramiona krótkie chromosomu nr 15.

Technika barwienia NOR

  Wybarwiają się obszary aktywnych organizatorów 

jąderka wszystkich chromosomów akrocentrycznych.

•

Połączenie technik biologii molekularnej 
z technikami klasycznej cytogenetyki

•

Identyfikacja rearanżacji chromosomowych 
i chromosomów markerowych „de novo”

•

Detekcja niektórych aberracji chromosomowych 
w komórkach okresu interfazy (cytogenetyka 
interfazowa)

•

Określanie punktów złamań chromosomowych;

       badania nad strukturą i funkcją 

specyficznych regionów chromosomowych

•

Mapowanie fizyczne (fiber FISH) 

Cytogenetyka molekularna

- założenia

1

2

3

4

5

Sonda molekularna 
DNA (dwuniciowa)

Wektor (plazmid)

denaturacja

dextran

hybrydyzacja

gen

Proces hybrydyzacji in situ

Techniki cytogenetyki 

molekularnej

• FISH 

( fluorescencyjna hybrydyzacja in situ )

• M-FISH 

( wielokolorowy FISH )

• SKY 

( spektralna analiza widmowa kariotypu )

• CGH 

( porównawcza hybrydyzacja genomowa )

Technika FISH

wzbudzenie

emisja

fluorochrom

„sonda” DNA

filtr optyczny

DAPI

TRITC

+

Zastosowanie techniki FISH 

•

Charakterystyka cytogenetyczna 

aberracji strukturalnych 
chromosomów

•

Wykrywanie 

aneuploidii/poliploidii

•

Wykrywanie 

aberracji 

chromosomowych specyficznych 
dla chorób nowotworowych

Technika FISH 

- typy sond molekularnych

  

sonda 

centromerowa 

sonda 

unikalna

z kontrolą 

płytki metafazowe 
- identyfikacja chromosomów 

cytogenetyka interfazowa 
- aberracje liczbowe chromosomów  

identyfikacja regionu chromosomowego 
zaangażowanego w rearanżację
chromosomową  

identyfikacja chromosomu

sonda 

malująca 

identyfikacja chromosomów
markerowych

identyfikacja regionów chromosomowych
zaangażowanych w translokacje

Technika FISH 

- płytka metafazowa 

LSI SNRPN

CEP13,21/CEP14,22

LSI13/LSI18/LSI21/CEPX/CEPY

FISH

dwukolorowa FISH

wielokolorowa FISH

Interfazowy FISH

CEP Y

Multiplex FISH   

M – FISH

Pula sekwencji DNA 
każdego 
chromosomu jest 
bezpośrednio 
znakowana jednym 
lub kilkoma z pięciu 
wykorzystywanych 
fluorochromów 

dzięki czemu po 
hybrydyzacji 
uzyskuje się 
unikalny kolor dla 
każdego z 24 
chromosomów 

1
2
3
4
5
6
7
8
9

10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22

X
Y

500

600

700

500

600

700

Multiplex FISH   

M – F I S H

•

Rejestracja obrazu przy użyciu 

monochromatycznej 

kamery CCD

 (w skali szarości) oddzielnie dla każdego 

z 5 fluorochromów

•

Składanie obrazów i przypisanie pseudokolorów 
dla każdej pary chromosomowej 

• „Kolorowy”

 kariotyp

•

Analiza chromosomów 

nie jest możliwa

 bezpośrednio 

pod mikroskopem

Multiplex FISH   

M–FISH

Spectral Karyotyping

SKY

•

Generowanie „obrazu” płytki metafazowej na podstawie 
pomiaru spektrofotometrycznego dla każdego piksela w 
odpowiedniej macierzy obrazu

•

Przypisanie pseudokolorów dla każdej pary 
chromosomowej na podstawie uzyskanego wzoru (widma) 
spektralnego

• „Kolorowy”

 kariotyp

Diagnostyka :

•

translokacji chromosomowych zwłaszcza tych 
obejmujących więcej niż dwa chromosomy

•

chromosomów markerowych

M–FISH i SKY - aplikacje

Określanie punktów złamań chromosomowych?

•

Detekcja 

utraty lub amplifikacji

 regionów chromosomowych na 

poziomie prążka chromosomowego

•

Bez konieczności prowadzenia hodowli komórkowej

•

DNA  badane i referencyjne wyznakowane różnymi 
fluorochromami

•

Jednoczesna hybrydyzacja do kontrolnego preparatu 
cytogenetycznego

•

Porównanie natężenia fluorescencji w chromosomów danej 
pary

•

Możliwość detekcji różnic w ilości kopii DNA pomiędzy 
referencyjnym i badanym DNA

CGH - założenia

BADANE DNA - ?

KONTROLNE DNA – 46,XY

Cot-1 DNA

PREPRAT KONTROLNY - 

46,XY 

fragmenty DNA - 300-600 bp

SR-dUTP

SG-dUTP

Nick Translation

KO-DENATURACJA (73°C, 5-8’)

HYBRYDYZACJA (37°C, 3 dni) 

0,3% NP-40

3’, 70°C 

0,1% NP-

40

1’, 

t.pok. 

REJESTRACJA OBRAZU, IDENTYFIKACJA CHROMOSOMÓW, ANALIZA 

STATYSTYCZNA

POLISOMIA,

DUPLIKACJA

MONOSOMIA

,

DELECJA

CGH

ANALIZA STATYSTYCZNA

„więcej kopii danej 

sekwencji w badanym 

DNA”

„więcej kopii danej 

sekwencji w 

kontrolnym DNA”

„tyle samo 

kopii danych 

sekwencji w 

badanym i 

kontrolnym 

DNA”

COMPRATIVE GENOMIC 
HYBRIDIZATION

 

RENUMERICAL

GREEN/RED

RATIO

KARIOTYPE

REFERENCE 

DNA

(RED)

TEST DNA

(GREEN)

CGH 

FINDINGS

+

+

+

+

4/2=2,0

3/2=1,5

2/2=1,0

1/2=0,5

TOTAL LOSS

TETRASOMY

TRISOMY

DISOMY

MONOSOMY

0/2=0,0

46,XX

Y

X

„brak 

sekwencji 

chromosomu 

Y w 

badanym 

DNA”

„więcej 

sekwencji 

chromosomu 

X w 

badanym 

DNA”

47,XX,

+21

Y

21

21

X

„więcej 

sekwencji 

chromosomu 

21 w 

badanym 

DNA”

•

Detekcja 

aneuploidii 

chromosomowych oraz 

amplifikacji DNA w trakcie diagnostyki 
nowotworowej

•

 

•

Identyfikacja 

chromosomów markerowych

 w 

trakcie diagnostyki pre- i postnatalnej  

•

Detekcja 

niezrównoważonych aberracji 

chromosomowych

 w trakcie diagnostyki pre- 

i postnatalnej

•

Analiza chromosomów nie jest możliwa 
bezpośrednio pod mikroskopem

CGH - aplikacje

!!! CGH nie umożliwia detekcji zrównoważonych aberracji chromosomowych !!!

Zastosowanie technik 
cytogenetyki molekularnej

PREPARATY CYTOGENETYCZNE

•

Chromosomy 
metafazowe 

•

Jądra interfazowe 

       

ABERRACJE CHROMOSOMOWE

•

Liczbowe

•

Strukturalne

•

Mikrodelecje/duplikacje

(+

)

(+

)

(+

)

(+

)

(+

)

(-)

(-)

(+)

(+)

(?)

(+)

(-)

(+)

(+)

(-)

FISH

CGH

M-

FISH

Podsumowanie

• Hodowla komórkowa
• Analiza kariotypu z wykorzystaniem 

technik prążkowych 

• Zastosowanie dodatkowych technik 

cytogenetyki molekularnej (jeżeli jest 
taka konieczność)

• Wynik + epikryza diagnostyczna