SEKWENCJONOWANIE
SEKWENCJONOWANIE
ANALIZY MOLEKULARNE
ANALIZY MOLEKULARNE
pozwalają na wykrycie osób
pozwalają na wykrycie osób
z wysokim ryzykiem
z wysokim ryzykiem
zachorowania na nowotwory
zachorowania na nowotwory
(bezobjawych nosicieli
(bezobjawych nosicieli
mutacji), co umożliwia
mutacji), co umożliwia
skuteczną i tańszą
skuteczną i tańszą
profilaktykę.
profilaktykę.
G.K.
W czasie średniego życia
człowieka ma miejsce 10
17
podziałów komórkowych.
Każdy wymaga wprowadzenia
we właściwe miejsce 6x10
9
nukleotydów
10
17
x 6x10
9
= 6x10
26
- okazji
do błędów
600000000000000000000
000000
W czasie średniego życia
człowieka ma miejsce 10
17
podziałów komórkowych.
Każdy wymaga wprowadzenia
we właściwe miejsce 6x10
9
nukleotydów
10
17
x 6x10
9
= 6x10
26
- okazji
do błędów
600000000000000000000
000000
POZIOMY
WYKRYWANIA
MUTACJI
1. DNA
2. RNA
3. BIAŁKO
BADANIE DNA
IZOLACJA DNA
PCR
SEKWENCJONOWANIE
METODY PRZESIEWOWE
SEKWENCJONOWANIE
Technika
bezpośredniego
wykrywania małych mutacji:
- substytucji
- małych insercji
- małych delecji
SEKWENCJONOWANIE
Wykrywa blisko 100% mutacji w
obrębie analizowanego produktu
(występowanie zanieczyszczeń
może obniżyć
jakość tej
metody).
CHEMICZNA METODA
MAXAMA-GILBERTA
1.
W metodzie tej fragment DNA poddany
sekwencjonowaniu musi być znakowany na
jednym końcu, co zwykle uzyskuje się przez
przyłączenie:
- albo radioaktywnego fosforanu do końca
5’ lub 3’
cząsteczki
- albo radioaktywnego nukleotydu do końca
3’
2.
Znakowany DNA poddaje się reakcjom
zrywania w miejscach występowania
określonych zasad
3.
Uzyskane fragmenty rozdziela się na żelu
metodą eletroforezy
METODA SANGERA
W metodzie tej stosuje się cztery specyficzne
dideoksynukleotydy
(ddNTP)
do zatrzymania
enzymatycznej
syntezy
kopii
matrycy.
Starter sekwencyjny przyłącza się do
jednoniciowej matrycy i polimeraza DNA
wykorzystując
dNTP
wydłuża
starter.Uzyskane produkty reakcji PCR
rozdziela się elektroforetycznie na żelu
poliakrylamidowym
ANALOG 2’,3’ - ddNTP
P P
P
OCH
2
H
O
ZASADA
H
H
H
AUTOMATYCZNE
SEKWENCJONOWANIE
Znaczny postęp w technologii
sekwencjonowania osiągnięto
poprzez wprowadzenie
automatycznych aparatów do
sekwencjonowania, których
funkcjonowanie oparte jest na
fluorescencji wzbudzonej laserem.
Każdy z dNTP (ACTG) jest
wyznakowany innym fluorochromem
G.K.
Rys.1a Zasada SSCP
----
A
----A
A
----AA
T
----AAT
G
----AATG
C
----AATGC
G
----AATGCG
C
----AATGCGCT
A
----AATGCGC
T
----AATGCGCTA
T
----AATGCGCTAT
G
----AATGCGCTATG
T
----AATGCGCTATGT
T
----AATGCGCTATGTT
C
----AATGCGCTATGTTC
T
----AATGCGCTATGTTCT
A
----AATGCGCTATGTTCTA
T
----TTACGCGATACAAGATAA--------
matryca
produkty
----AATGCGCTATGTTCTAT
T
-
+
Idea sekwencjonowania
Porównanie sekwencji badanej -fragmentu
eksonu 18 hMLH1 do sekwencji z bazy danych
-”U07343 Gene Bank”
sekwencja badana
zgodność sekwencji
sekwencja wzorcową
chromatogram
sekwencji badanej
z mutacją
obraz żelu
odpowiadający
sekwencji
z mutacjà
Obraz żelu sekwencyjnego odpowiadający
wykrytej zmianie w obrębie eksonu 18 genu
MLH1
ETAPY
SEKWENCJONOWANIA
PCR preparatywny -
namnożenie wybranego
fragmentu genu przy użyciu pary specyficznych
starterów
Oczyszczenie
PCR
preparatywnego
na
selektywnych filtrach
PCR asymetryczny -
z jednym ze starterów z
zastosowaniem dideoksynykleotydów
Elektroforeza
na denaturującym żelu
poliakrylamidowym z równoczesną detekcją
i rejestracją przepływających produktów
Analiza
wyników przy użyciu pakietu programów
komputerowych
ETAPY
SEKWENCJONOWANIA
PCR preparatywny -
namnożenie wybranego
fragmentu genu przy użyciu pary specyficznych
starterów
PCR
(POLYMERASE CHAIN
REACTION)
SKŁAD MIESZANINY REAKCYJNEJ:
- matryca DNA
- polimeraza termostabilna
- para specyficznych starterów
(primers)
- trójfosforany deoksyrybonukleotydów
(dNTP)
- bufor (zawierający Mg
2+
)
- H
2
O
ETAPY CYKLU PCR
1. DENATURACJA
podwójnej nici DNA - 92-94
o
C
2. PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW
~ 60
o
C
3. ELONGACJA
- 72
o
C
ILOŚĆ KOPII DNA = 2
n
n - ilość cykli
G.K.
Prnciple of a Polymerase Chain Reaction (PCR )
5’
3’
separation of strands
and primer attachment
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
primer elongation
separation of strands
and primer attachment
(1. cycle)
(2.
cycle etc.)
Primer 1
Primer 2
complementary to primer 2
complementary to primer 1
amplification of target sequence
ETAPY
SEKWENCJONOWANIA
PCR preparatywny -
namnożenie wybranego
fragmentu genu przy użyciu pary specyficznych
starterów
Oczyszczenie
PCR
preparatywnego
na
selektywnych filtrach
PCR asymetryczny/sekwencyjny -
z jednym ze
starterów z zastosowaniem dideoksynykleotydów
SKŁAD MIESZANINY
REAKCYJNEJ
PCR SEKWENCYJNEGO
- oczyszczona matryca w postaci PCR preparatywnego
- jeden starter
- Mieszanina deoksyrybonukleotydów (dNTP) i
fluorescencyjnych dideoksyrybonukleotydów (ddNTP)
- polimeraza
- bufor
- woda
MUTACJA
-
zmiana
sekwencji
DNA
powodująca uszkodzenie
struktury i funkcji białka
POLIMORFIZM
- zmiana
sekwencji
DNA
nie
powodująca uszkodzenia
struktury i funkcji białka
BADANA SEKWENCJA
DNA
• 5’ACTGCCGTACGACATGCATGCATGA3’
TACGTACT
• ACTGCCGTA
• 3’TGACGGCATGCTGTACGTACGTACT5’