SEKWENCJONOWANIE
SEKWENCJONOWANIE
• Technika ustalania kolejności
nukleotydów w sekwencji DNA
• Dzięki elektroforezie w żelu
poliakryloamidowym następuje
rozdział cząsteczek DNA różniących
się jednym nukleotydem
• Dwie metody wprowadzone w
latach 70tych
METODY SEKWENCJONOWANIA
METODY SEKWENCJONOWANIA
METODA CHEMICZNEJ DEGRADACJI DNA
(Maxama i Gilberta)
• Sekwencję DNA określa się działając na
wyznakowany radioaktywnie dwuniciowy DNA
związkami chemicznymi, które rozszczepiają
cząsteczki w specyficznych miejscach
poszczególnych nukleotydów
METODA TERMINACJI ŁAŃCUCHA
(Sangera,dideoksy)
• Sekwencję cząsteczki jednoniciowego DNA określa
się dzięki syntezie komplementarnych łańcuchów a
reakcje są zatrzymywane losowo w pozycjach
określonych nukleotydów
• Automatyczne sekwencjonowanie z
wykorzystaniem dideoksyrybonukleotydów
wyznakowanych fluorescencyjnie
CO POTRZEBUJEMY DO REAKCJI
CO POTRZEBUJEMY DO REAKCJI
SEKWENCJONOWANIA METODĄ
SEKWENCJONOWANIA METODĄ
TERMINACJI ŁAŃCUCHA?
TERMINACJI ŁAŃCUCHA?
• Jednoniciowa matryca – przed reakcją nić
DNA denaturujemy
• Starter
• Polimeraza DNA
• Trifosforany deoksyrybonukleotydów
dNTPy (Literki A, T, C, G)
• Trifosforany dideoksyrybonukleotydów
ddNTPy – pozbawione grupy 3’-
hydroksylowej, niezbędnej do utworzenia
reakcji z następnym nukleotydem
Sekwencjonowanie DNA
denaturacja
dwuniciowy DNA
jednoniciowy DNA
(matryca do sekwencjonowania)
przyłączenie znakowanego startera
starter
podział na 4 oddzielne reakcje
wydłużania startera
A T C G
rozdział produktów reakcji sekwencjonowania
w żelu poliakrylamidowym
pozostałe składniki reakcji
Sekwencjonowanie DNA
A T C G
G
A
C
C
T
G
A
C
T
G
T
A
5’
3’
CO OTRZYMUJEMY NA
CO OTRZYMUJEMY NA
KOŃCU?
KOŃCU?
Sekwencjonowanie DNA
denaturacja
dwuniciowy DNA
jednoniciowy DNA
(matryca do sekwencjonowania)
przyłączenie znakowanego startera
starter
podział na 4 oddzielne reakcje
wydłużania startera
A T C G
rozdział produktów reakcji sekwencjonowania
w żelu poliakrylamidowym
pozostałe składniki reakcji
Sekwencjonowanie DNA
A T C G
G
A
C
C
T
G
A
C
T
G
T
A
5’
3’
