Diagnostyka molekularna w medycynie

Główne kierunki analizy DNA

Genomowy DNA

Amplifikacja DNA

Hybrydyzacja molekularna

Amplifikacja in-vitro

- Southern Blot

PCR

- Northern Blot

- Dot Blot

- DNA Fingerprinting

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych



metoda badania oparta na zdolności tworzenia kompleksu

dwuniciowego przez jednoniciowe fragmenty kwasów

nukleinowych,



polega na wzajemnym oddziaływaniu pomiędzy badanym

fragmentem kwasu nukleinowego a sondą molekularną,

które prowadzi do wytworzenia hybrydu (dupleksu) o

dwuniciowej strukturze,



w przypadku dwuniciowego fragmentu kwasu

nukleinowego tworzenie hybrydu poprzedzone jest

denaturacją pod wpływem działania zasad lub wysokich

temperatur,

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

cd.



proces łączenia sondy molekularnej z fragmentem

docelowym kwasu nukleinowego jest wysoce specyficzny i

zachodzi zgodnie z zasadą komplementarności,



odpowiednio przygotowana sonda molekularna, w

optymalnych warunkach rozpoznaje sekwencje różniące się

zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe kompleksy,



badany kwas nukleinowy może być denaturowany i

unieruchamiany na filtrach, a następnie poddawany

procesowi identyfikacji za pomocą znakowanej

radioaktywnie lub nieradioaktywnie sondy molekularnej.

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

cd.



– jest to tzw.

odwracalny punkt topnienia

– temperatura

przy której istnieje równowaga dynamiczna pomiędzy

hybrydami rozpadającymi się w wyniku denaturacji i

tworzącymi się w wyniku renaturacji,



ze statycznego punktu widzenia w tej temperaturze 50%

hybryd ulega rozpadowi,



Tm zależy od wielu czynników: stężenia jonów Na

, liczby par

G-C, długość hybrydy, stężenia formamidu lub mocznika.

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

cd.

Zjawisko hybrydyzacji umożliwia tworzenie kompleksów

różnych molekuł zwanych inaczej hybrydami:

•

DNA – DNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) wiąże się do

komplementarnego ssDNA analizowanej sekwencji,

•

DNA – RNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) tworzy

hybryd z komplementarną cząsteczką RNA,

•

RNA – RNA, gdy sonda (wyznakowany RNA) łączy się z

komplementarna cząsteczką RNA.

Stabilność wyżej wymienionych hybrydów jest

zróżnicowana:

RNA –RNA > DNA –RNA > DNA –DNA

Sondy molekularne

W analityce molekularnej wykorzystuje się sondy

oligonukleotydowe pochodzenia naturalnego (kilkaset

nukleotydów), które można otrzymać przez określone zabiegi

molekularne np. klonowanie lub sondy syntetyzowane

chemicznie (zwykle o długości 10 – 50 nukleotydów).

Zalety sond syntetycznych:

- stosunkowo łatwa dostępność,

- możliwość dowolnego programowania sekwencji sond,

- nie ma potrzeby denaturacji, gdyż sonda jest jednoniciowa,

- krótki czas hybrydyzacji,

- wysoka selektywność.

Znakowanie sond molekularnych

Znakowanie najczęściej wykonuje się poprzez wprowadzenie

radioizotopu

P w miejsce niepromieniotwórczych atomów

fosforu.

Można tego dokonać poprzez:

- przeniesienie z udziałem kinazy polinukleotydowej reszty

fosfonowej [

P] ze znakowanego ATP na koniec 5’ cząsteczki

sondy

lub

- wbudowując w łańcuch sondy [

P] – deoksyfosfonukleozydy w

procesie „nick translation” (uzupełnienie przerw w dwuniciowej

cząsteczce DNA, wywołanych uprzednio przez endonukleazę).

W korzystaniu z tego typu sond metodą wykrywania utworzonych

struktur hybrydowych jest bezpośrednia autoradiografia.

Znakowanie sond molekularnych

Powszechnie stosuje się również techniki niepromieniotwórcze w

znakowaniu sond molekularnych, polegające na dołączaniu biotyny

lub digoksygeniny.Produkty hybrydyzacji wykrywa się wówczas w

procesach dwustopniowych:

Etap I:

użycie streptawidyny wiążącej się wybiórczo z biotyną lub

przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko biotynie czy

digoksygeninie,

streptawidyna i przeciwciała sprzężone są z enzymami

(peroksydaza chrzanowa lub fosfataza zasadowa).

Etap II:

w/w enzymy w obecności odpowiednich substratów powodują

reakcje barwne lub wywołują zjawisko chemiluminescencji.

Hybrydyzacja Southern

(ang. Southern blot hybridization)



hybrydyzacja mająca na celu identyfikację określonego

fragmentu DNA,



najczęściej dotyczy hybrydyzacji DNA – DNA,

Hybrydyzacja Southern cd.

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie DNA

z komórek lub tkanek.

2. Trawienie DNA

odpowiednimi restryktazami.

3. Rozdział elektroforetyczny

fragmentów DNA według

wielkości i ich denaturacja

situ

Hybrydyzacja Southern cd.

4. Przeniesienie fragmentów DNA z

żelu na filtr nitrocelulozowy lub

nylonowy.

5. Związanie DNA z filtrem: w

temperaturze 80°C lub poprzez

naświetlanie UV.

6. Hybrydyzacja z sondą.

7. Ustalenie położenia fragmentów ,

do których zhybrydyzowała sonda z

użyciem autoradiografii , reakcji

barwnych lub fluorescencji.

Hybrydyzacja Southern cd.

Hybrydyzację z sondą dzielimy na trzy etapy:

1. Prehybrydyzacja:

- eliminacja niespecyficznego tła poprzez moczenie filtru w

roztworze, którego składniki blokują miejsca mogące

związać kwasy nukleinowe na filtrze,

- w celu zminimalizowania tła dodaje się również

niehomologiczne DNA nośnikowe.

2. Właściwa hybrydyzacja:

- wyznakowana sonda wiąże się z unieruchomionymi na

filtrze kwasami nukleinowymi,

- wysoka homologia: temperatura (65°C), mniejsze

stężenie soli, dodatek formamidu,

- częściowa homologia: temperatura (55°C) , wyższe

stężenie soli.

3. Płukanie filtru:

- usunięcie niezhybrydyzowanej sondy – jest to warunek

specyficznego obrazu hybrydyzacji.

Zastosowanie hybrytyzacji Southern

Hybrydyzacja Southern umożliwia:

- wykrycie rearanżacji genowych (np. delecje, insercje)

większych niż 50 pz,

- badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych

DNA – RFLP (restriction fragment length polymorphism).

Polimorfizm może mieć charakter naturalny lub może

wystąpić w wyniku zmian mutacyjnych w DNA, które

powodują zanikanie bądź pojawianie się miejsc

restrykcyjnych.

Analiza RFLP wykorzystywana jest m.in. w badaniach

dziedzicznych uwarunkowań chorób jak również w

wykrywaniu mutacji somatycznych w badanych genach.

Hybrydyzacja Northern

(ang. Northern blot hybridization)

Jest to metoda

służąca

detekcji kwasów rybonukleinowych

(RNA).

Najczęściej stosuje się ją do badania aktywności określonych

genów

(badanie ekspresji genów).

Metodyka zbliżona jest do hybrydyzacji Southern:

rozdział elektroforetyczny RNA na żelu w warunkach

denaturujących,

przeniesienie RNA na odpowiednią membranę,

utrwalenie RNA na membranie,

hybrydyzacja RNA z sondą,

odpłukanie nadmiaru sondy i detekcja.

Sonda daje syngał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na

membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można

ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.

Hybrydyzacja Dot - blot

- metoda półilościowa,

- umożliwia jednoczesne wykrywanie i

identyfikację wielu próbek na tym

samym filtrze,

- pozwala na bezpośrednie stosowanie

komórek hodowanych

in vitro

lub

bakterii w miejsce kwasów

nukleinowych,

- stosowana do wykrywania wirusów w

diagnostyce chorób zakaźnych

zwierząt chodowlanych.

DNA Fingerprinting

(genetyczny odcisk palca)



Metoda oparta na hybrydyzacji Southerna.



Opracowana w 1984 roku przez Brytyjczyka Aleca Jeffreysa.



Polega na izolowaniu i sporządzaniu obrazów fragmentów

DNA.



Wykorzystuje obecność w genomie polimorficznych

sekwencji powtórzonych VNTR (variable number of tandem

repeats) – zmienna liczba tandemowych powtórzeń.

Występowanie w eukariotycznym DNA sekwencji

powtórzonych, cechujących się dużą zmiennością, nadaje

DNA poszczególnych osobników cechy indywidualne.

DNA Fingerprinting cd.

Metedyka:

- trawienie wyizolowanego DNA odpowiednimi enzymami

restrykcyjnymi, które tną kwasy nukleinowe w specyficznych

miejscach,

- rozdzielenie i sortowanie poprzez rozdział elektroforeteczny

pocięte fragmenty DNA,

- przeniesienie rozdzielonych fragmentów DNA na filtr

nitrocelulozowy i hybrydyzacja z wyznakowanymi sondami,

- detekcja.

DNA Fingerprinting cd.

W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi

rozpoznajacymi jednocześnie od kilkunastu do

kilkudziesięciu

loci

otrzymuje się dla każdego osobnika

charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. DNA

fingerprint.

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy

(ang. polymerase chain reaction)



Należy do najczęściej stosowanych technik biologii

molekularnej.



W znaczny sposób przyśpieszyła uzyskiwanie wyników

w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów.



Umożliwia specyficzną amplifikacje

in vitro

wybranych

odcinków DNA i RNA.



Charakteryzuje się wysoką czułością.

PCR

Rys historyczny



Izolacja polimerazy DNA z

Thermus aquaticus

(Chien

1974).



Wydłużanie starterów przy udziale fragmentu Klenowa

polimerazy I z

E.coli

(Panet i Khorana 1974).



Cykliczne wydłużanie starterów (Saiki i wsp. 1985).



Zastosowanie termostabilnej polimerazy (Mullis i

Faloona 1987, Saiki i wsp. 1998).



Klonowanie genu (Lawyer i wsp. 1989).

PCR

Rekordy

1. Długość fragmentu 6 kpz (obecnie 40 kpz fag lambda)

Ponce MR, Micol JL. PCR amplification of long fragments.

Nucleic Acids Res. 20, 623, 1992

2. Pojedynczy włos

Higuchi R., von Beroldingen C.H., Sensabauch S.A., Erlich H.A.

DNA typing from single cells. Nature 340, 35-42, 1988

3. Pojedyncza komórka

Li H., Gyllensten U.B., Cui X., Saiki R.K., Erlich H.A., Arnheim N.

Amplification and analysis of DNA sequences in single human

sperm and diploid cells. Nature 335, 414-417, 1988

4. Pojedynczy oocyt

Coutelle C., Williams C., Handyside A., Hardy K., Winston R.,

Williamson R. Genetic analysis of DNA from single human

oocytes: a model for preimplantation diagnosis of cystic fibrosis.

Br. Med.. J. 299, 22-24, 1989

PCR

Założenia reakcji

Technika enzymatycznej amplifikacji określonych

sekwencji DNA.

Specyficzność reakcji zapewniają dwa startery

komplementarne do sekwencji docelowej.

Czułość reakcji pozwala amplifikować DNA

pojedynczych genów ponad 1 000 000 razy mimo

obecności innych sekwencji.

Możliwość amplifikacji pojedynczych matryc.

PCR

Przebieg reakcji

Cykle reakcji PCR:

Denaturacja wstępna -

92-95

Cykle (25-35)

Denaturacja

92-95

Wiązanie starterów -

40-62

Synteza

68-72

Synteza końcowa

68-72

Przechowywanie

PCR

Skład mieszaniny reakcyjnej

1. Matryca DNA (RNA)

2. Startery

3. dNTP

4. MgCl

5. Polimeraza Taq

6. Bufor

PCR

Matryca

1. Ilość DNA

1ng - 1

2. Wyjściowa liczba matryc

3 x 10

DNA człowieka

DNA drożdży

10 ng

DNA

E.coli

1 ng

3. Stopień czystości

Pomiar UV

Elektroforeza

4. Metoda izolacji

Inhibitory

PCR

Startery

1. Stężenie

0.1 - 0.5

2. Stężenie wyjściowe

18 - 28 nt

3. Zawartość GC

50 - 60%

4. Tm

55 - 72

5. Stężenie wyjściowe

200 - 1000 pmoli/

6. Stężenie robocze

10 pmoli/

Uwagi:

Zbyt duże stężenie – niespecyficzny produkt

Dimery starterów – komplementarne końce

3’

PCR

dNTP

1. pH

7.0

2. Stężenie wyjściowe

5 - 10 mM

3. Stężenie w reakcji

20 - 200

4. Przechowywanie

-20

Uwagi:

Po 30 cyklach PCR 50% nukleotydów występuje jako

dNTP. Korzystniej stosować mniej dNTP niż zbyt dużo.

M każdego dNTP wystarcza do syntezy 2.6 ng

DNA

lub 10 pmoli sekwencji o długości 400 pz.

PCR

MgCl

1. Jony Mg

wiązane są przez

Startery

Matrycę

Polimerazę

dNTP

2. Stężenie

0.5 - 2.0 mM

PCR

Polimeraza

1. Stężenie

0.5 - 5 jedn./100

2. Przechowywanie

-20

3. Okres półtrwania

92.5

C 2 godz.

92.0

C 40 min.

97.5

5 min.

4. Temperatura

68 - 72

5. Synteza

30 - 100 nt/sek. (2 kpz/min)

Uwagi:

Za dużo polimerazy – niespecyficzne produkty

Za mało polimerazy – brak produktu

Najczęstszy błąd – za dużo cykli

Liczba matryc

Liczba cykli

3 x 10

25 - 30

1.5 x 10

30 - 35

PCR

Bufor

1. pH

8.3 - 8.8

2. Tris-HCL

10 - 50 mM

3. Sole

<50 mM

4. „Wzmacniacze” reakcji

DMSO, Żelatyna, BSA, Tween 20

Analiza produktów PCR

1. Elektroforeza w żelach agarozowych

- barwienie bromkiem etydyny,

- autoradiografia.

2. Elektroforeza w żelach poliakryloamidowych

- barwienie bromkiem etydyny, srebrzenie,

- autoradiografia, fluorografia.

Główne zastosowanie PCR

Klonowanie

YAC, BAC, minigeny, produkty PCR

Hybrydyzacja

Klony cDNA, produkty PCR

Amplifikacja

PCR, RT-PCR, PCR multipleks, RFLP-PCR,

Real-time PCR, nasted-PCR, RAPD-PCR,

RACE-PCR, ASA-PCR, competitive-PCR

Sekwencjonowanie

Klony genomowe i cDNA, produkty PCR

RT-PCR

(ang. reverse transcriptase PCR)

Matrycą wyjściową jest RNA, które w procesie

odwrotnej

transkrypcji jest przepisywane na

komplementarne DNA

(

ang. complementary DNA –

cDNA). Następnie cDNA

ulega amplifikacji, jak w zwykłym PCR.

Zastosowanie:

Badanie ekspresji genów.

PCR multipleks

Metoda polega na jednoczesnej amplifikacji kilku

fragmentów DNA, różniących się wielkością, co w

praktyce polega na użyciu w jednej mieszaninie

reakcyjnej kilku par starterów.

Zastosowanie:

Jednoczesna amplifikacja kilku regionów

jednego lub kilku genów. W jednej

reakcji

uzyskać można nawet 13

amplikonów.

PCR-RFLP

(ang. restriction fragment length polymorphism PCR)

Połączenie reakcji PCR z analizą restrykcyjną. Produkty

amplifikacji poddaje się działaniu enzymu restrykcyjnego

i porównuje wzór powstałych prążków.

Zastosowanie:

Wykrywanie znanych mutacji/polimorfizmów.

Analiza bezpośrednia – mutacje

Analiza pośrednia – polimorfizmy

Real-time PCR

(PCR w czasie rzeczywistym)

Metoda ilościowa pozwalająca na obserwowanie amplifikacji

w czasie rzeczywistym. Wraz z przybywaniem produktów PCR

wzrasta intensywność fluorescencji rejestrowanej przez detektor.

Odzwierciedlone jest to w postaci wykresu na monitorze

komputera.

Zastosowanie:

Pomiar liczby cząsteczek wirusów lub bakterii w

materiałach

klinicznych.

Umożliwia monitorowanie postępów leczenia

(określenie wyjściowego poziomu wiremii lub

bakteriemii jest

wskazaniem koniecznym do

rozpoczęcia właściwego leczenia).

Nested-PCR

(PCR gniazdowy)

Stosowane są dwie pary starterów: zewnętrzna

(komplementarna do końców poszukiwanej sekwencji)

i wewnętrzna (przyłącza się przyśrodkowo w stosunku do

pierwszej pary starterów). Produkt powstały po amplifikacji

z pierwszą parą starterów poddaje się kolejnej amplifikacji z

druga parą. Zapewnia to większą specyficzność metody.

Zastosowanie:

Szybka diagnostyka zakażeń wirusowych.

RAPD-PCR

(ang. random amplified polymorphic DNA)

Wykorzystywana, gdy nieznane są sekwencje specyficzne.

Stosuje się krótkie uniwersalne startery, którymi amplifikuje

się zbiór produktów, a ich liczba i długość są zależne od

sekwencji nukleotydowej matrycy oraz warunków reakcji.

Zastosowanie:

Określenie zmienności genetycznej bez

informacji o sekwencji

analizowanego DNA

RACE-PCR

(ang. rapid amplification of cDNA ends)

Technika umożliwiająca otrzymanie pełnej długości

sekwencji gdy znany jest tylko fragment.

Zastosowanie:

Klonowanie cDNA.

ASA-PCR

(ang. allele specific amplification)

Technika umożliwiająca wykrywanie mutacji przy

pomocy specyficznych oligonukleotydów. Oprócz

starterów flankujących stosuje się starter w pełni

komplementarny do allela z mutacją lub startery, z

kórych jeden jest w pełni komplementarny do allela

z mutacją a drugi do allela niezmutowanego.

Startery są tak zlokalizowane, że w wyniku PCR

powstają produkty różniące się długością w

zależności od genotypu użytej próbki DNA.

Zastosowanie:

Wykrywanie znanych mutacji.

Competitive-PCR

(PCR konkurujący)

W mieszaninie reakcyjnej umieszcza się DNA badane

oraz DNA kontrolne o znanym stężeniu. W wyniku

konkurowania o reagenty ilość produktu DNA

kontrolnego będzie odwrotnie proporcjonalna do

ilości DNA badanego w probówce.

Zastosowanie:

Ocena ilościowa produktu.

Document Outline