Klonowanie genów

Biblioteki genomowe

Reakcja PCR

Metody powielania 

sekwencji DNA

Łączenie fragmentów DNA ciętych 

enzymami restrykcyjnymi

Klonowanie

•Trawienie wektora enzymem restrykcyjnym

•Trawienie interesującego nas fragmentu DNA tym 
samym enzymem

•Łączenie – fragmentu z wektorem (ligacja)

•Wprowadzenie plazmidu do bakterii 
(transformacja) 

•Wysiewanie bakterii na płytkę z odpowiednim 
antybiotykiem

•Minipreparatyka DNA z pojedynczych kolonii

•Trawienie enzymem restrykcyjnym (wycinanie 
„wstawki”)

•Elektroforeza

•Namnażanie bakterii z kolonii zawierających 
wstawkę

•Bankowanie

Wektory

•Plazmidowe – najmniejsze, 
nadają się do klonowania 
fragmentów do kilku tysięcy 
pz

•Fagowe – większe, 
klonowanie fragmentów do 
kilkudziesięciu tysięcy pz

•Drożdżowe – największe, 
klonowanie fragmentów 
kilkuset tysięcy pz i więcej

Biblioteki genomowe

Biblioteka genomowa 
jest zbiorem różnych 
sekwencji 
sklonowanych w 
wektorach

Przeszukiwanie biblioteki

Biblioteki fagowe (fag Lambda)

Biblioteka genomowa

 

Biblioteka cDNA

Reakcja PCR (Polymerase Chain Reaction)

•Najczulsza metoda wykrywania i 
powielania fragmentów DNA o 
określonej sekwencji

•Pozwala na wykrycie i amplifikację 
pojedynczej kopii interesującej 
sekwencji

Główne etapy reakcji PCR

•Denaturacja wyjściowych cząsteczek DNA

•Wiązanie primerów (annealing)

•Wydłużanie łańcucha (extension)

Denaturacja

Annealing

(wiązanie 
primerów

)

Extension
(wydłużanie)

Powielone cząsteczki

PCR

Temperatura jest najważniejszym 

czynnikiem wpływającym na wynik 

w reakcji PCR

PCR

Primery (startery)

1. długość 18-25 nukleotydów
2. skład 40-60% GC
3. nie powinny zawierać odwróconych powtórzeń 
4. temperatura topnienia podwójnoniciowej cząsteczki 

tworzonego przez 

   oba primery z matrycą powinna być 

podobna

5. na końcu 3’ powinny mieć G lub C, ale nie więcej niż 

jeden nukleotyd

Denaturacja

•Temperatura zależy od składu zasad fragmentu który chcemy 
powielić

•Przy fragmentach bogatych w GC używać polimeraz bardziej 
opornych na wysoką temperaturę

•Najpopularniejsza polimeraza używana standartowo w PCR – Taq 
wytrzymuje temperaturę 94-95 stopni C

Annealing

Temperatura za wysoka – słaba wydajność, 

za niska niespecyficzne powielanie

Stosuje się temperaturę około 3-5 stopni poniżej oszacowanej 
temperatury topnienia

[Praktyczny wzór na temperaturę topnienia dla primera o 20 
nukleotydach:

T=2x(A+T) + 4(G+C)]

Extension

Temperatura tej części cyklu zależy od właściwości polimerazy. 
Dla polimerazy Taq optymalna jest temperatura 72-78 stopni
Szybkość reakcji w optymalnych warunkach około 2000 
nukleotydów/min

PCR

Anemia sierpowata

RFLP PCR – polimorfizm długości fragmentów 
restrykcyjnych

Reverse Transcription PCR

Real Time PCR

Pozwala na śledzenie 
akumulacji produktów w 
trakcie przebiegu 
reakcji PCR 

Sekwencjonowani

e DNA

 (metoda 

dideoxy-)

Nukleotydy dideoxy- powodują 
zakończenie replikacji DNA 

Sekwencjonowanie 

DNA

C

G

Znakowanie 
sekwencjonowane
go 

fragmentu 

pojedynczym 
nukleotydem

Znakowanie końcowego 

nukleotydu (dideoxy)

Odczytywanie sekwencji DNA

Metoda chemiczna sekwencjonowania polega na 

wykorzystaniu specyficznych wobec 

poszczególnych zasad reakcji chemicznych, co 

pozwala na identyfikację miejsca występowania 

danej zasady

Zasada

Specyficzna modyfikacja

G

Metylacja N7 dimetylosiarczanem w pH 8.0 
sprawia, że wiązanie C8-C9 staje się specyficznie 
wrażliwe na rozkład przy pomocy zasady.

A+G

Mrówczan piperydyny w pH 2.0 osłabia wiązania 
glikozydowe puryn, co powoduje depurynację

C+T

Hydrazyna otwiera pierścień pirymidynowy, który 

następnie recyklizuje w formę podatną na 
usunięcie

C

W obecności 1.5 M NaCl jedynie cytozyna reaguje 
specyficznie z hydrazyną

A>C

1.2 N NaOH w temp. 90

0

C powoduje częste 

przecinanie reszt A i rzadsze - C

Piperydyna przecina łańcuch fosfocukrowy w miejscu modyfikacji zasady

Odczytywanie sekwencji

Specyficzne znakowanie jednej 

nici DNA przy użyciu fragmentu 

Klenowa polimerazy I

Sekwencjonowanie automatyczne
W  systemie  tym  stosuje  się  nukleotydy  dideoxy  lub  startery 
znakowane czterema różnymi znacznikami fluorescencyjnymi. 
Można stosować sekwencjonowanie rozpoczynające się od jednego 
startera
i  zatrzymujące  się  na  znakowanych  nukleotydach  dideoxy. 
Wszystkie cztery znakowane nukleotydy dideoxy występują wtedy 
w jednej mieszaninie. 
Inną  możliwością  jest  stosowanie  znakowanych  starterów, 
prowadzenie czterech niezależnych reakcji, a następnie rozdział na 
jednej  ścieżce  żelu.  Po  reakcji  mieszanina  nanoszona  jest  na  żel 
poliakrylamidowy,
a  elektroforeza  prowadzona  jest  w  aparacie  wyposażonym  w 
detektor promieniowania. 

System 

ABI 

(Applied 

Biosystems 

Incorporated) 

używa 

czterech 

znakowanych 

fluorescencyjnymi 

barwnikami 

ddNTPs

  i  polimerazy  Taq 

(AmpliTaq).

Wzbudzanie  fluorochromów  i  detekcja  emisji 
mają  miejsce  w  określonej  pozycji  w  pobliżu 
dolnej  części  żelu.  Dane  są  odczytywane  na 
podstawie spektrum emisyjnego kolejnych pasm 
mijających 

detektor

w  czasie  elektroforezy.  Dane  przekazywane  są 
do komputera podłączonego do urządzenia

.

 

Sekwencjonowanie cykliczne 

(połączenie metody PCR i 

sekwencjonowania) pozwala

na liniową amplifikację sygnału