Diagnostyczne badania chorób zakaźnych i interpretacja wyników

Laboratoryjne metody

rozpoznawania chorób

zakaźnych

epidemiologia

II rok

Rozmazy i wymazy

preparaty pobieramy bezpośrednio z
materiału chorobowego albo z
hodowli bakterii lub grzybów

mleko, krew lub mocz – wirujemy
(powoduje to zagęszczenie materiału,
preparat robimy z osadu)

ropa, wykrztusiny, tkanki, hodowle
bakterii na podłożach płynnych –
robimy bezpośrednio preparaty
mazane

- z hodowli na podłożach stałych

rozcieramy odrobinę materiału w

kropli płynu fizjologicznego

- preparaty wykonujemy na czystych i

odtłuszczonych szkiełkach

podstawowych

- materiał nanosimy wyjałowioną ezą i

rozprowadzamy po powierzchni

tworząc cienki rozmaz

- preparat suszymy i utrwalamy

( termicznie lub chemicznie )

- wykonujemy barwienie ( metoda

Grama, Giemsy, May-Grunwalda )

Barwienie pozytywne

: barwi się

komórki bakteryjne przy niezabarwionym
tle.
- może być przyżyciowe lub pośmiertne

Barwienie negatywne

: na

zabarwionym tle widać niezabarwione
komórki
- zastosowane przy obserwacji
drobnoustrojów
delikatnych,trudnobarwiacych się oraz
pewnych składników komórki np. otoczek

Obserwacja ruchu bakterii

oglądamy w mikroskopie świetlnym,
mikroskopie ciemnego pola widzenia i
fazowo-kontrastowym

przygotowujemy zwykle preparaty
wilgotne (otrzymane przez przykrycie
cienkim szkiełkiem nakrywkowym kropli
hodowli bakteryjnej) lub tzw. krople
wiszącą

Kropla wisząca

umieszczamy krople hodowli na środku

szkiełka nakrywkowego

z góry przykrywamy szkiełkiem

podstawowym z wgłębieniem

energicznym ruchem odwracamy

preparat szkiełkiem nakrywkowym do

góry

brzegi kropli odszukujemy pod

obiektywem o małym powiększeniu

następnie przechodzimy na większe

Mikroskop fazowo-
kontrastowy

potrafi przekształcić rożne prędkości
przechodzenia światła przez rożne
elementy komórki bakteryjnej i
środowiska na intensywność światła

przy tej samej zdolności rozdzielczej
umożliwia obserwacje przyżyciową i
pozwala na wyróżnienie szczegółów
budowy wewnętrznej

Mikroskop ciemnego pola
widzenia

pozwala on na uwidocznienie

niebarwiących się drobnoustrojów

oświetla obiekt pozostawiając ciemne

tło

obiekt oświetlony jest z boku, tak że do

obiektywu trafia tylko część promieni

rozproszonych przez komórki bakteryjne

na ciemnym tle silnie oświetlony

drobnoustrój

Zawiesiny i rozciery
badanego materiału

stosujemy do zakazania zwierząt

doświadczalnych, zarodków kurzych oraz

hodowli

materiał rozdrabniamy następnie

rozcieramy próbki z małą ilością płynu i

jałowym piaskiem lub rozbijamy za pomocą

odpowiednich młynków elektrycznych

po homogenizacji zawiesinę wirujemy

w celu izolacji wirusa z

zawiesiny,pozbywamy się bakterii

przepuszczając ją przez przez sączki

bakteryjne lub dodając antybiotyk

Preparaty odciskowe

bierzemy fragment badanej tkanki,
narządu

odciskamy na podłożu hodowlanym

inkubujemy

Podłoża

Płynne

Półpłynne

Stałe

Bulion

Bulion +

0,25-0,5%
agar-agaru

Żelatynowe

(bulion+żelat
yna)

Mleko

Agarowe
(bulion+agar)
Ścięta

surowica
Ścięte

podłoże

jajowe

Z punktu widzenia wartości
użytkowej podłoża dzielimy
na:

1.Podstawowe
2.Wzbogacone
3.Wybiorcze ( selektywne )
4.Różnicujące

Podłoża podstawowe:

Pozwalają na rozwój większości bakterii
o przeciętnych wymogach wzrostowych.
Stanowią podstawę do przygotowania
innych typów pożywek.Zaliczamy do
nich:

bulion odżywczy

agar odżywczy

żelatynę odżywczą

Podłoża wzbogacone:

Służą do hodowli drobnoustrojów o

znacznych wymaganiach odżywczych,
które słabo lub wcale nie rosną na
podłożach podstawowych.Jako
substancje je wzbogacające stosuje się:

krew

surowicę

wyciąg drożdżowy

glukozę

żółtko jaja

Podłoża wybiórcze:

Służą do wyosobniania tylko określonych

gatunków drobnoustrojów z materiału

zakażonego inna florą.Są to podłoża

podstawowe do których dodano czynniki

wzmagające wzrost danych bakterii (np.żółć w

pożywce Muller-Kauffmanna- wzmaga

namazanie pałeczek Salmonella) oraz hamujące

rozwój niepożądanych drobnoustrojów

( np.zieleń brylantowa w pożywce Muller-

Kauffmanna hamuje wzrost E.coli )Zaliczamy tu

tez podłoża:

Brylla-Szynkiewicza

SF z kwaśnym selenianem Na

Podłoża różnicujące:

Stosowane do rozróżnienia poszczególnych

gatunków bakterii na podstawie ich

odmiennych właściwości biochemicznych. Są

to pożywki podstawowe z dodatkiem

substratu umożliwiającego określenie

właściwości enzymatycznych

zarazków.Zaliczamy do nich:

Soltysa

McConkey’a

Edwards-Chodkowskiego

Identyfikacja drobnoustrojów:

Odbywa się na podstawie własności:

morfologicznych

hodowlanych

- biochemicznych
- antygenowych

Badanie morfologiczne:

Zwykle jest przeprowadzane w dwóch etapach:

Wstępna obserwacja preparatów

wykonanych bezpośrednio z materiału

chorobowego (np.mleko,ropa,krew)

2. Obserwacja preparatów z hodowli

bakteryjnych wyrosłych na podłożu

sztucznym

W badaniu morfologicznym uwzględnia się:

Kształt,wielkość,ułożenie komórek,obecność

lub brak otoczek,rzęsek i zarodników a

także sposób barwienia się

Badanie hodowlane:

Wysianie próbki materiału hodowlanego
i inkubacja posiewów w odpowiedniej
temperaturze przez określony czas. Ma
ono na celu uzyskanie zarazka w czystej
kulturze i określenie właściwości
morfologicznych wyrosłych kolonii
bakteryjnych.W dalszym etapie
przeprowadza się charakterystykę jego
właściwości fizjologicznych poprzez
hodowle na specjalnych podłożach.

Badanie biochemiczne:

Mają na celu dokładniejsze określenie
rodzaju drobnoustroju na podstawie
charakteryzujących go reakcji
biochemicznych.Zaliczamy tutaj np.
testy API,próby na katalazę.

Antybiogram

Pozwala na wybór najlepszego

antybiotyku o największym zakresie

działania i największej skuteczności

przeciwko wyizolowanej

bakterii.Najczęściej stosujemy metodę

krążkową.Krążki nasycone antybiotykiem

nakładamy na zasianym podłożu

bakteryjnym i inkubujemy w

37C.Dyfundujący antybiotyk powoduje

powstanie wokół krążka stref

zahamowania wzrostu proporcjonalnych

do stopnia wrażliwości szczepu.

Badanie histopatologiczne

Rozstrzyga ono często w przypadkach

wątpliwych badań klinicznych i

sekcyjnych.Stosowane w rozpoznaniu wielu

chorób wirusowych,chorobach bakteryjnych,

które cechują się zapaleniem swoistym, w

niektórych chorobach pasożytniczych i

grzybicach.Obecność ciałek wtrętowych

Negriego wskazuje na wściekliznę,

sródjądrowe ciałka wtrętowe w

hepatocytach- ch.Rubartha,ciałka Joest-

Degena-ch.bornajska.Typowe zmiany w

postaci gruzełków występują w gruźlicy i

nosaciźnie.

Mikroskop elektronowy

Przyrząd elektronooptyczny, w którym

powiększony obraz przedmiotu

otrzymuje się za pomocą wiązki

elektronowej, odchylonej i skupionej

przez soczewki elektronowe; pozwala

uzyskać znacznie lepszą

rozdzielczość(0,2 nm) dzięki znacznie

krótszej od fal świetlnych (o kilka rzędów

wielkości) długości fal de Broglie`a

odpowiadających elektronom.

Główną częścią mikroskopu

elektronowego jest komora próżniowa.

Wyrzutnia elektronowa emituje wiązkę

elektronów, które są przyspieszane

wysokim napięciem i osiągają znaczną

prędkość. Wiązka elektronowa

skupiona przez soczewki elektronowe,

przenika przez badany preparat,

a następnie zostaje powiększona

przez układ soczewek elektronowych

i pada na ekran fluorescencyjny lub

błonę fotograficzną, tworząc b. silnie

powiększony obraz prześwietlanego

preparatu.

Izolacja wirusów w hodowli
tkankowej i efekt
cytopatogenny:

Istota metody polega na pobraniu tkanek i

komórek zwierzęcia żywego lub zabitego i

umieszczeniu ich w odpowiednich płynach

i warunkach zapewniających podtrzymanie

procesów życiowych.Hodowla tkankowa

pozwala otrzymać wirus w postaci

stosunkowo czystej,co jest ważne przy

sporządzaniu szczepionek oraz Ag do prób

serologicznych.Przez wielokrotne pasaże

są duże szanse na otrzymanie szczepów

atenuowanych przydatnych do produkcji

szczepionek.

Najważniejszą korzyść stanowi
znaczne ułatwienie i potanienie
diagnostyki
wirusologicznej.Rozpoznanie
opierające się na wykazaniu w
hodowli efektu cytopatycznego
badanego wirusa, ulęgającego
zahamowaniu pod wpływem surowic
swoistych, jest pewne i szybsze niż
na zwierzętach doświadczalnych.

Izolacja wirusa w zarodkach
kurzych

Do izolacji używamy jaj SPF ( specific

patogen free ).Kury od których pobieramy

jaja nie mogą być szczepione zapobiegawczo

przeciwko chorobie której czynnika

etiologicznego się poszukuje.Zarodki zakaża

się zwykle w 2-gim tyg.inkubacji, podając

wirus do woreczka żółtkowego,jamy

omoczniowej, owodniowej i na błonę

kosmówkowo-omoczniową. Zwykle po 2-7 dni

po zakażeniu zbiera się płyn zawierający

duże ilości wirusa.Często dochodzi do

zamierania zarodków.

Dobór zwierząt wrażliwych

ideał: zwierzęta tego samego gat.co

zwierze chore

znajomość przeszłości

epizootiologicznej zwierząt

doświadczalnych

najlepsze z własnej hodowli lub

poddane dłuższej obserwacji i

ewentualnym badaniom stopnia ich

wrażliwości na zakażenie

( dosis letalis )- jest to ilość

substancji,wirusów, bakterii, która
powoduje śmierć 50% badanych
zwierząt doświadczalnych

Pasażowanie

pasażowanie bakterii i wirusów-

kolejne, wielokrotne przenoszenie

drobnoustrojów z jednej pożywki na

następną lub z jednego organizmu

żywego na drugi; ma na celu osłabienie

ich działania chorobotwórczego.Ma

zastosowanie w produkcji

atenuowanych szczepionek.

Przykłady zastosowania

Próba biologiczna w kierunku wścieklizny:

do badania:białe myszki,wiek:3-4tyg.masa:8-12g.

na każdy badany materiał:co najmniej 6 myszek

domózgowo badaną zawiesinę w ilości 0,03ml

okres obserwacji: ok. 30dni

okres inkubacji: 10-14 dni

pierwsze objawy: posmutnienie, nastroszenie sierści,

niedowłady tylnych kończyn,porażenia

wynik kliniczny badania musi być poparty

stwierdzeniem c.wtrętowych Negriego lub dodatnim

odczynem IF

- wynik ujemny nie wyklucza zakażenia



METODY POŚREDNIE WYKRYWANIA

ZARAZKÓW

Podział:



Metody klasyczne:



aglutynacja



immunodyfuzja w żelu agarowym (AGID)



odczyn wiązania dopełniacza (OWD)



immunofluorescencja pośrednia i
bezpośrednia (IF)



odczyn seroneutralizacji (SN)

•

Metody nowsze:



ELISA



Immunobloting (Western Blot)



Sondy genetyczne

Materiał pobierany do badań:



krew



surowica



plazma



płyny ustrojowe (płyn mózgowo-rdzeniowy,
płyny wysiękowe)



wydzieliny



wydaliny



wymaz z błon śluzowych



Odczyny serologiczne – są to
metody, za pomocą których można
wykazać obecność i stężenie
przeciwciał w surowicy i innych
płynach tkankowych, bądź też
wykryć antygen przy użyciu znanej
surowicy odpornościowej

Odczyn precypitacji:
Polega na łączeniu się antygenu

koloidalnego (bezpostaciowego) ze
swoistym przeciwciałem (precypityną) w
obecności elektrolitów

Wynik reakcji

charakteryzuje się wytworzeniem
zmętnienia, a później tworzeniem się
delikatnego precypitatu. Modyfikacja tego
odczynu umożliwia określenie wysokości
miana przeciwciał w surowicy krwi, niekiedy w
innych płynach ustrojowych (śluz macicy).
Próba pierścieniowa stosowana do
wykrywania antygenu znajduje praktyczne
zastosowanie w diagnostyce wąglika
(odczyn Ascoliego).

antygen

pierścień
precypitacyjny

surowica

Próba pierścieniowa

Odczyn precypitacji w żelu (Test podwójnej
immunodyfuzji):

Polega on na łączeniu się

koloidalnego antygenu
ze swoistym
przeciwciałem w
nośniku, jakim jest
najczęściej żel agarowy.
Modyfikacją tego testu
jest immunodyfuzja
radialna, w której
antygen migruje z
basenika do żelu
nasyconego swoistymi
przeciwciałami lub na
odwrót.



Immunoelektroforeza:

Odczyn przeprowadza się w cienkiej warstwie

agaru pokrywającego szkiełko podstawowe. Do
baseników wprowadza się badane antygeny i
poddaje elektroforezie. Poszczególne frakcje
antygenowe ulegają rozdzieleniu w polu
elektrycznym. Centralny rowek napełnia się
surowicą odpornościową zawierającą
przeciwciała przeciwko badanym antygenom. W
miejscu max. koncentracji kompleksu
przeciwciało – antygen powstają łuki
precypitacyjne

Antygen

Surowica

Prążki
precypitacyjne

IMMUNOELEKTROFOREZA

Immunoblotting

Immunoblotting - metoda

służąca do identyfikacji
antygenów.Polega na
przenoszeniu rozdzielonych
elektrolitycznie białek z
podłoża, na którym
wykonano elektroforezę, na
specjalna błonę, np.
nitrocelulozową.
Poszczególne antygeny
mogą być następnie
identyfikowane za pomocą
znakowanych swoistych
przeciwciał.



Odczyn aglutynacji:



Polega na wiązaniu się przeciwciała ze swoistym

antygenem na powierzchni takich cząstek jak:

bakterie, krwinki, plemniki itp. Co powoduje ich

zlepianie czyli aglutynacje. Cząstki muszą mieć

średnicę powyżej pół mikrometra – ograniczone

zastosowanie – wirusy są zbyt małe.



Aglutyniny – przeciwciała



Aglutynat – produkt aglutynacji (zlep)



Miano – odwrotność najwyższego

rozcieńczenia surowicy, przy którym następuje

jeszcze widoczny odczyn aglutynacji.



Techniki aglutynacji bezpośredniej:



Aglutynacja probówkowa



Aglutynacja płytkowa



Odczyn hemaglutynacji – polega na
wiązaniu się antygenów obecnych na
powierzchni krwinek przez przeciwciała



Techniki aglutynacji pośredniej:

Test antyglobulinowy Coombsa

Test ten służy do wykrywania niekompletnych
przeciwciał. Przeciwciała takie są
jednowartościowe, tzn, że mają tylko jedną
grupe chwytną i po połączeniu ze swoistym
antygenem tworzą małe kompleksy
niewypadające z roztworu (brak wyraźnej reakcji
aglutynacji).Aby uzyskać widoczne aglutynaty
należy użyć przeciwciał antyglobulinowych.
Odzczyn ten wykorzystywany jest w diagnostyce
brucelozy



Odczyn hamowania hemaglutynacji:



Szereg drobnoustrojów ma zdolność
hemaglutynowania czerwonych krwinek ssaków
(E.Rhusiopathie, M.gallisepticum, wirus grypy,
wirus ND).Tracą one tą właściwość po związaniu ze
swoistym przeciwciałem. Odczyn ten jest
wykorzystywany do identyfikacji nieznanego
zarazka o właściwościach hemaglutynacyjnych,
przy użyciu swoistej surowicy lub do wykrywania
przeciwciał w swoistej surowicy przy użyciu znanego
wirusa.

Niektóre hemaglutyniny wirusowe:
hemaglutynina wirusa grypy,
hemaglutynina wirusa odry, świnki i
różyczki mają zdolność do zlepiania
erytrocytów:

erytrocyty

wirusy

aglutynacja
erytrocytow

erytrocy
ty

wirusy

brak
hemaglutynacji

Właściwość ta nie ma nic
wspólnego z reakcjami
serologicznymi, jest jednak
wykorzystywana w
diagnostyce - w teście
hamowania
hemaglutynacji



Odczyn immunofluorescencji:



Jest niezwykle czułą metodą serologiczną, służącą
do wykrywania antygenu znajdującego się w
tkankach, płynach ustrojowych, a także w
wydalinach i wydzielinach. W tym celu stosuje się
tak zwane koniugaty, tj.swoiste przeciwciała
znakowane barwnikeim fluoryzujacym
(fluorochromem) np.:izocyjanianem fluoresceiny. Po
naświetlaniu promieniami UV barwnik emituje
intensywne światło widzialne barwy zielonej co
pozwala stwierdzić obecność kompleksów antygen
przeciwciało.



Bezpośredni odczyn IF:



Służy do wykazania obecności antygenu w

badanym materiale. Przeciwciała znakuje się

barwnikiem FITC i pokrywa nimi preparat np.:

rozmaz inkubuje się i następnie przemywa się

kilkukrotnie w celu usunięcia niezwiązanych z

preparatem przeciwciał. Po wysuszeniu ogląda

się w mikroskopie fluorescencyjnym.Obecność

zielono-żółtych kompleksów dowodzi

występowania antygenu. Zastosowanie w

badaniu na obecność prątków gruźlicy.

• Pośredni odczyn IF:

Stosuje się go do wykazania antygenu w
tkankach. Preparat pokrywa się swoistą
surowicą i po inkubacji spłukuje się
buforowanym r-m NaCl. Następnie pokrywa
się surowicą antyglobulinowa znakowaną
FITC i po ponownej inkubacji i przemyciu
preparat ogląda się pod mikroskopem
fluorescencyjnym. Obecność ognisk
fluorescencji dowodzi obecności antygenu.

odczyn IF
bezpośredni

odczyn IF
pośredni



Test ELISA



Metoda polega na koniugacji enzymu z antygenem albo z

przeciwciałem i użyciu aktywności enzymatycznej tego

enzymu jako znacznika ilościowego. Aktywność

enzymatyczna mierzy się po dodaniu swoistego

substratu, natężenie reakcji barwnej mierzy się

kolorymetrycznie.



Pomiar stężenia przeciwciał - polega na

umieszczeniu znanego antygenu na mikropłytce i

inkubacji z rozcieńczeniami badanej surowicy, przemyciu

i ponownej inkubacji z anty-immunoglobulinną

znakowaną enzymem np.: peroksydaza chrzanowa.

Aktywność enzymatyczną mierzy się po dodaniu

swoistego substratu.



Pomiar stężenia antygenu – znane swoiste
przeciwciało umiejscawia się na fazie stałej,
dodaje się materiał badany, który zawiera
antygen, płucze się a następnie dodaje drugie
przeciwciało znakowane enzymem. Próba
wymaga użycia antygenu, który ma co najmniej
dwie determinanty. Po przemyciu dodaje się
substratu i mierzy aktywność enzymatyczną
odnosząc ją do stężenia antygenu



RIA – badania radioimmunologiczne



Jest to najczulsza metoda oznaczania
ilościowego substancji o właściwościach
antygenu lub haptenu, o których znakowania
wykorzystuje się izotopy radioaktywne.
Zasada metody podobna do testu ELISA.



OWD – odczyn wiązania dopełniacza
Służy do wykrywania i określania przeciwciał lub
antygenu.
I układ – testowy: antygen + badana surowica
pozbawiona dopełniacza + świeża surowica świnki
morskiej. Jeżeli w badanej surowicy są przeciwciała
wiążą one antygen, a powstały kompleks przyłącza
w całości dopełniacz.
II układ – wskaźnikowy: zawiesina erytrocytów
barana + surowica królika uodpornionego
krwinkami barana bez dopełniacza (amboreceptor
hemolityczny)



W przypadku związania dopełniacza w pierwszym
układzie uczulone krwinki układu wskaźnikowego
nie ulegną lizie, natomiast liza krwinek w drugim
układzie świadczy o braku swoistych przeciwciał
w badanej surowicy układu testowy.



Przed nastawieniem OWD składniki obu układów
muszą być dokładnie wymiareczkowane. Dodanie
ściśle określonej ilości dopełniacza ma znaczenie
zasadnicze. Nadmiar komplementu będzie zawsze
powodował rozpuszczenie krwinek, natomiast zbyt
mała jego dawka wywoła niekompletną hemolizę.



OWD znajduje szerokie zastosowanie w
diagnostyce chorób zakaźnych np. brucelloza,
nosacizna, choroba pęcherzykowa świń;
oraz w określeniu serotypów
poszczególnych drobnoustrojów np. wirus
pryszczycy.



Pośredni OWD



Stosuje się go przy badaniu surowic ptaków,
które po związaniu się ze swoistym
antygenem nie przyłączają dopełniacza świnki
morskiej. Trudność tę rozwiązano
wprowadzając do odczynu szósty składnik –
surowicę odpornościową ssaka zawierającą
swoiste przeciwciała dla użytego antygenu
( surowica wskaźnikowa)

Odczyn konglutynacji

Układ pierwszy: zamiast surowicy świnki
morskiej jako źródła dopełniacza używa się
surowicy końskiej zawierającej
niekompletny dopełniacz

Układ drugi: miejsce amboceptora
hemolitycznego zajmuje surowica bydlęca,
zawierająca tzw. konglutyninę
wykorzystywaną jako wskaźnik wiązania
niekompletnego dopełniacza. Odczyn ten
znajduje zastosowanie przy badaniu
surowic źrebnych klaczy, osłów i mułów.



Zastosowanie niekompletnego dopełniacza
zapobiega nieswoistemu wiązaniu go przez
badane surowice. Jeżeli w surowicy badanego
zwierzęcia są obecne przeciwciała wiążą one
antygen i dopełniacz. Krwinki układu
wskaźnikowego nie ulegają wówczas aglutynacji.
W przypadku braku swoistych przeciwciał w
badanej surowicy nie związany dopełniacz z
pierwszego układu przechodzi do układu drugiego
wywołując wraz z konglutyniną silna aglutynację
krwinek barana.

PCR



Metoda ta sprowadza się do uzyskania

w jednej probówce, przy pomocy kilku

odczynników w ciągu kilku godzin z

jednej sekwencji DNA do biliona jego

kopii.



Amplifikacje DNA uzyskuje się w

wyniku równoczesnego kopiowania

przy pomocy odpowiedniego enzymu

dwóch komplementarnych nici DNA.



Pozwala na: uzyskanie mierzalnych

ilości DNA oraz powielenie ściśle

określonego odcinka DNA.



Mieszaninę reakcyjną stanowią: DNA
służące jako matryca i dwa startery –
to krótkie oligonukleotydy o
sekwencjach komplementarnych do
obu końców odcinka DNA
poddawanego amplifikacji.



Do powielenia DNA wykorzystuje się
polimerazę z termofilnej bakterii.
Enzym ten ze względu na swoją
termostabilność zachowuje
aktywność w trakcie kolejnych
denaturacji DNA w tem. 93ºC.



Ponadto deoksyrybonukleotydy i
odpowiedni układ buforowy.

Metody wykrywania



Powielone fragmenty DNA analizuje się
poprzez: elektroforeze w żelu
agarozowym, elektroforeze w żelu
poliakryloamidowym.



Do wykrywania DNA stosuje się bromek
etydyny dla żelu agarozowego i azotan
srebra dla żelu poliakryloamidowego.

Document Outline