W2

Klonowanie

Enzymy wykorzystywane

w obróbce DNA in vitro

• Nukleazy
• Ligazy
• Fosfatazy
• Kinazy
• Glikozylazy
• Metylotransferazy
• Polimerazy

Łączenie fragmentów 

DNA

Fragmenty DNA mogą być połączone przy pomocy 

ligazy, jeżeli ich końce mają odpowiadające sobie 

sekwencje i właściwe grupy funkcyjne 3’ i 5’

Plazmidy

•

Plazmid  –  pozachromosomowa,  kolista  cząsteczka 
DNA zawierająca niezależny początek replikacji

•

Wektory  plazmidowe  są  plazmidami  sztucznie 
zmodyfikowanymi,  dzięki  czemu  lepiej  nadają  się
do obróbki w probówce

•

Typowe modyfikacje

:

–

Stałe  miejsce  do  klonowania  zawierające  szereg 
unikalnych miejsc restrykcyjnych (polilinker)

–

Obecność 

co 

najmniej 

jednego 

markera 

selekcyjnego (np. oporności na antybiotyki)

–

Obniżona ilość DNA

Polilinker zawiera szereg pojedynczych miejsc restrykcyjnych

  

Schemat budowy wektora plazmidowego

Inne wektory

Bakteriofagi:

lambda i jego pochodne (dwuniciowe)
M13 i jego pochodne (jednoniciowe)

Sztuczne chromosomy bakteryjne
Sztuczne chromosomy drożdżowe
Wektory drożdżowe
Wektory bakulowirusowe (z wirusów owadzich)
Pochodne wirusów roślinnych
Pochodne plazmidów bakterii zakażających rośliny
Pochodne wirusów zakażających komórki ludzkie

Antybiotyki

i geny 

oporności 

powszechnie 

wykorzystywa

ne w biologii 

molekularnej

Wektory ekspresyjne

Klonowanie

Główne etapy 

klonowania

1) 

Trawienie próbki DNA 

enzymem restrykcyjnym.

2) 

Trawienie DNA wektora 

enzymem restrykcyjnym.

3) 

Ligacja próbki DNA

 z wektorem.

4) 

Transformacja bakterii 

(E. coli) produktem ligacji.

5) 

Wzrost bakterii na płytkach 

agarowych

z antybiotykiem 

selekcyjnym.

6) 

Detekcja

 interesujących nas klonów. 

Łączenie różnych fragmentów 

DNA

• Wektor-konkretna wstawka
• Biblioteka genomowa

 

Trawienie badanego DNA

Trawienie wektora tym samym enzymem restrykcyjnym

 

Ligacja plazmidu i 

wstawki

Recyrkularyzacja (religacja) 

plazmidu

T4 ligaza

Zapobieganie religacji 

plazmidu

• Wykorzystanie alkalicznej fosfatazy
• Klonowanie ukierunkowane
• Adaptory

Wykorzystanie alkalicznej fosfatazy

do zapobieżenia ponownej ligacji 

wektora

Zdefosforylowany  wektor 
(posiadający  grupy  OH 
przy końcu 3’ i 5’) nie jest 
odpowiednim  substratem 
dla  ligazy  DNA.  Jest  nim 
natomiast 

kombinacja 

zdefosforylowanego 
plazmidu 

i 

ufosforylowanego 

(przy 

końcu  5’)  DNA  wstawki. 
Jako  produkt  końcowy 
otrzymuje  się  wektor  ze 
wstawką
i 

z 

pojedynczym 

nacięciem
w każdej z nici.

Klonowanie 

ukierunkowane

Trawienie  dwoma 
różnymi 
enzymami 
restrykcyjnymi 
umożliwia 
włączenie 
żądanego 
fragmentu tylko w 
jednej 

orientacji

i 

zabezpiecza 

przed 

religacją 

wektora.

Adaptory i łączniki

Łączenie tępych końców 

DNA

1. 

Ligowanie 

cząsteczek 

wektora
i 

wstawki, 

przy 

dużym 

stężeniu  DNA  oraz  ligazy  z 
faga T4

2.  Zamykanie  pierścienia  po 
rozcieńczeniu 

DNA, 

transformacja 

i 

selekcja 

bakterii

Najczęściej używane metody 
transformacji bakterii to: 

Metoda chemiczna:

 wykorzystująca 

CaCl

2 

(również mieszaniny innych soli i chlorek 
sześcioaminokobaltowy) oraz szok 
termiczny. 

Elektroporacja:

 

 oparta na krótkim 

pulsowym zadziałaniu prądu 
elektrycznego.

Biolistyka:

 bombardowanie komórek 

mikrocząstkami opłaszczonymi DNA.

Transformacja  E. coli K-

12

produktem ligacji

Transformacja chemiczna

Elektroporacja

Biolistyka (gene-

gun)

Wysiewanie bakterii na 

szalki

Identyfikacja 

poszukiwanych 

rekombinantów

A Identyfikacja 

zrekombinowanych 

plazmidów:

1. System 

oparty 

na 

aktywności 

-

galaktozydazy
(-komplementacja)

2. Analiza wielkości plazmidu

B Identyfikacja konkretnego klonu:

1. Przeszukiwanie  kolonii  przy  użyciu  metod 

hybrydyzacyjnych (duża ilość kolonii)

2. Przeszukiwanie  kolonii  przy  pomocy  PCR 

(niewielka ilość kolonii)

System ekspresyjny indukowany IPTG

Funkcja 

enzymatyczna 

beta-

galaktozydazy  może  zostać  odtworzona  z 
dwóch  fragmentów  polipeptydowych,  z 
których 

żaden 

oddzielnie

nie jest aktywny.
Fragment  genu  kodujący  koniec  aminowy
(tzw.  fragment  alfa)  jest  obecny  na 
plazmidzie, 

podczas 

gdy 

C-końcowy 

(fragment 

omega) 

 

występuje 

w 

chromosomie  bakteryjnym  gospodarza, 
lub na plazmidzie pomocniczym.

Wykorzystanie genu beta 

galaktozydazy (lac Z) E.coli do 

systemu detekcji 

stransformowanych kolonii

Bacterial DNA

X-gal =
5-bromo-4-chloro-
3-indolilo--D-

galaktozyd

Niebieskie 

kolonie 

reprezentują 

bakterie 

oporne 

na 

ampicylinę,  które  zawierają  wektor  i  produkują  funkcjonalny 
fragment 

alfa

z nieuszkodzonej sekwencji kodującej LacZ alfa (brak insertu). 
Białe  kolonie  reprezentują  bakterie  oporne  na  ampicylinę, 
które zawierają wektor z insertem i nie produkują aktywnego 
fragmentu alfa LacZ. 

Elektroforeza trawionego 

plazmidu

Identyfikacja rekombinantów

przez hybrydyzację

Przeszukiwanie kolonii przy 

pomocy PCR

Startery specyficzne dla poszukiwanej wstawki 

pozwalają na identyfikację poszukiwanej 

sekwencji.

Wykorzystanie starterów 

flankujących wstawkę pozwala 

na wykrycie wszystkich 

rekombinantów