TECHNIKI ANALIZY DNA

Wykrywanie mutacji



Wykrywanie mutacji w sekwencji 
DNA jest często kluczowe dla 
zrozumienia procesu wywoływania  
przez gen specyficznej choroby



Metody molekularne rozwinięte 
ostatnio pozwoliły na opracowanie 
licznych technik wykrywania mutacji 
na poziomie DNA

Techniki analizy DNA



Enzymy restrykcyjne



Hybrydyzacja



Amplifikacja DNA metodą PCR



Analiza RFLP



PCR Multipleks



Hybrydyzacja ASO



PCR w czasie rzeczywistym



Metody przesiewowe



Sekwencjonowanie



Diagnostyka pośrednia 



Analiza SSCP

ENZYMY RESTRYKCYJNE



 Rozpoznają specyficzne sekwencje 
w obrębie dsDNA, co w efekcie 
prowadzi do powstania ściśle 
określonych fragmentów DNA 
zarówno pod względem długości jak i 
struktury końców

HYBRYDYZACJA



Tworzenie podwójnej helisy pomiędzy 

komplementarnymi niciami DNA lub 

RNA pochodzącymi z różnych żródeł



Oddziaływanie badanego fragmentu 

DNA i sondy molekularnej prowadzi 

do utworzenia hybrydu (kompleksu) 

o dwuniciowej strukturze



Sonda musi być zdenaturowana 

(jednoniciowa), wyznakowana 

radioaktywnie lub fluorescencyjnie

HYBRYDYZACJA TYPU 
SOUTHERN (Southern 
blotting)



Stosowana najczęściej



Dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA



Można tą metodą wykryć:

 - rearanżacje genowe np. delecje albo 

insercja

 - mutacje punktowe

HYBRYDYZACJA TYPU 
NORTHERN BLOT



Dotyczy hybrydyzacji RNA-DNA



Stosowana w celu badania ekspresji  
określonych genów



Dostarcza dodatkowych informacji o 
występowaniu w badanych 
komorkach określonego RNA 

DNA fingerprinting



Wykorzystuje się obecność w genomie 

polimorficznych sekwencji 

powtórzonych VNTR (zmienna liczba 

tandemowych powtórzeń)



W wyniku badań hybrydyzacyjnych z 

sondami molekularnymi 

rozpoznającymi jednocześnie 

kilkanaście loci otrzymuje się dla 

każdego osobnika charakterystyczny 

obraz fragmentów DNA tzw. Fingerprint 

(odcisk genetyczny)

AMPLIFIKACJA DNA metodą 
PCR



Reakcja ta  odzwierciedla naturalny 
proces replikacji i umożliwia w 
warunkach in vitro szybkie 
powielenie wybranych odcinków DNA 
lub RNA, przepisanych na cDNA w 
reakcji odwrotnej transkrypcji

 

Analiza RFLP (polimorfizmu 

długości fragmentów restrykcyjnych)



Polimorfizmy  RFLP objawiają się  
utworzeniem lub zanikiem miejsca 
rzopoznawanego przez enzymy 
restrykcyjne lub zmianą liczby 
nukleotydów pomiędzy takimi 
miejscami



Zastosowanie – identyfikacja mutacji 
punktowych w obrębie miejsca 
rozpoznawanego przez enzym 
restrykcyjny np. fenyloketonuria

PCR Multipleks



Jednorazowo można amplifikować 10 
markerów



Można badać DNA zmieszany  i 
zdegradowany



Zastosowanie – duże mutacje 
genowe, delecje, duplikacje, insercje

HYBRYDYZACJA ASO



Hybrydyzacja z sondą specyficzną 
dla produktu DNA 



Sonda rozpoznaje allel dziki lu 
zmutowany



Zastosowanie – wykrywanie mutacji 
punktowych, które nie zmieniają 
miejsc restrykcyjnych np. 
mukowiscydoza

PCR w czasie 

rzeczywistym

 (Real time PCR)



Metoda ilościowa oparta na amplifikacji Dna 
in vitro – opiera się na pomiarze liczby kopii 
Dna, przez pomiar fluoroscencji



Zastosowanie:

   - ilościowe określanie ekspansji genów
   - testowanie stabilności genetycznej
   -  ilościowe określanie DNA wirusowego
   -  detekcja patogenow
   - wykrywanie trisomii i mikrodelecji
  

METODY PRZESIEWOWE – PCR-

SSCP



Analiza konformacji jednoniciowych 
DNA



Polega na porównaniu konformacji 
badanych fragmentów kwasów 
nukleinowych



Umozliwia wykrywanie punktowych 
zmian w DNA np. Z.Marfana

METODA SEKWENCJONOWANIA 
ENZYMATYCZNEGO SANGERA



Polega na enzymatycznej replikacji 
jednoniciowej matrycy Dna, 
rozpoczynającej się od jednego 
startera, a kończącej wbudowaniem 
dideoksynukleotydu do 
nowopowstałego łańcucha DNA

PIROSEKWENCJONOWANIE – 
SEKWENCJONOWANIE W CZASIE 
RZECZYWISTYM



Wykorzystuje się pirofosfoniuan 
uwalniany podczas syntezy Dna



W wyniku reakcji enzymatycznych 
docohdzi do emisji światła, jego 
intensywnosć zależy od ilości 
uwalnianego pirofosfonianu, czyli od 
liczby wbudowanych nukleotydów



Stosowana do genotypowania 
poznanych wcześniej polimorfizmów

DIAGNOSTYKA POŚREDNIA



 Analiza  asocjacji  - porównuje rozkład 
alleli różnych polimorfizmów pomiędzy 
grupą niespokrewnionych chorych a 
grupą kontrolną. Stosowana w 
chorobach uwarunkowanych 
wielogenowo/ wieloczynnikowo



Analiza sprzężeń – wykrywa 
sprzężenia pomiędzy markerami a 
poszukiwanymi genami,  wymaga 
badań rodzinnych. Stosowana w 
chorobach jednogenowych

POLIMORFIZM POJEDYNCZEGO NUKLEOTYDU 
– SNP (single nucleotide 
polymorphism)



Zjawisko  zmienności sekwencji DNA, 
która polega na zmianie 
pojedynczego nukleotydu  (A, T, G, 
C) pomiędzy osobnikami danego 
gatunku lub drugim, 
odpowiadajacym chromosomem 
danego osobnika