Slajd 1

ZASADY, TECHNIKA

PRACY ORAZ SPRZĘT

STOSOWANY

W LABORATORIUM

MIKROBIOLOGICZNYM

Podstawowa aparatura w

pracowni

mikrobiologicznej:



autoklaw oraz aparat Kocha do wyjaławiania

pożywek i niszczenia drobnoustrojów



sterylizator na suche gorące powietrze



suszarka do suszenia szkła laboratoryjnego



cieplarka do hodowli drobnoustrojów



chłodziarka do przechowywania szczepów i

pożywek



mikroskop z obiektywem imersyjnym



lupy do oglądania hodowli drobnoustrojów



waga techniczna i analityczna



pehametr do oznaczania pH pożywek



aparat do hodowli w warunkach beztlenowych

Podstawowy sprzęt:



ezy



pincety



skalpele



nożyczki



palniki



trójnogi



siatki laboratoryjne



statywy do probówek



puszki metalowe do pipet i płytek



termometry

Podstawowe szkło

laboratoryjne:



probówki bakteriologiczne duże i małe



płytki Petriego o różnych średnicach



pipety bakteriologiczne z podziałką,

pojemności 1cm

i 10cm



pipety pasteurowskie



kolby i butelki do przechowywania

pożywek i odczynników



kolby płaskodenne różnej pojemności



cylindry pomiarowe



szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe do

preparatów mikroskopowych



bagietki szklane, łyżeczki porcelanowe

1. Metody fizyczne:



Sterylizacja cieplna sucha-polega na wyżarzaniu w

płomieniu palnika ez, opalanie brzegów probówek i kolbek

oraz bagietek szklanych. Do tego rodzaju sterylizacji

zaliczamy także wyjaławianie szkła laboratoryjnego w

suszarce w temperaturze około 160˚C przez 2 godziny.



Sterylizacja cieplna z parą wodną- zaliczamy tutaj

sterylizację w autoklawie w temperaturze powyżej 100˚C i

pod ciśnieniem około 1,5 atmosfery przez 20 minut, a

także sterylizację w aparacie Kocha. Można też

przeprowadzić w tym aparacie zabieg jednokrotny w

temperaturze około 95˚C przez 30 minut.



Do tej grupy zalicza się w niektórych przypadkach

sterylizację przez gotowanie.



Wyjaławianie promieniami ultrafioletowymi przy pomocy

lamp kwarcowych

2. Metody mechaniczne:

Wyjałowienie cieczy możemy uzyskać poprzez

oddzielenie mikroorganizmów przy pomocy

specjalnych filtrów bakteriologicznych o

drobnych porach.

Istnieje wiele rodzajów takich filtrów

różniących się materiałem z którego są wykonane

oraz konstrukcją:

filtry Berkefelda wykonane z ziemi okrzemkowej,

filtry Chamberlana z nieglazurowanej porcelany,

filtry azbestowe,

filtry Schotta ze spiekanego szkła,

filtry membranowe przygotowane z kolodium,

żelatyny lub pergaminu.

3. Metody chemiczne

(dezynfekcja):

Przy pomocy substancji chemicznych można

przeprowadzić dezynfekcję różnych przedmiotów,

płynów, pomieszczeń. W tym celu można

zastosować:



Kwasy i zasady, jak np. mleko wapienne, od 1% do

10% gorące roztwory węglanu sodowego, mydła.



Środki utleniajace: chlorowce i ich pochodne,

nadmanganian potasowy, woda utleniona, 10%

roztwór jodu (jodyna), chloramina.



Sole metali ciężkich, zwłaszcza rtęci i srebra.



Rozpuszczalniki organiczne: 60-70% alkohol, 5%

roztwór fenolu, krezole, lizol, formalina.



Substancje zmniejszające napięcie

powierzchniowe-detergenty.

Pożywki hodowlane

nazywane też podłożami

mikrobiologicznymi,

są mieszaninami

odpowiednio dobranych

składników.

Służą do hodowli

mikroorganizmów w

warunkach laboratoryjnych,

w naczyniach (czyli

hodowlach

in vitro

dosłownie

w szkle

Podział pożywek na

podstawie pochodzenia

składników z których

zostały przygotowane:



naturalne - zawierają składniki

pochodzenia naturalnego, np. wyciągi z

tkanek roślinnych lub zwierzęcych,

ekstrakt glebowy, mleko, jaja, surowicę

krwi itp.



syntetyczne - przygotowane z różnych

substancji chemicznych



półsyntetyczne - zawierające składniki

naturalne jak też różne odczynniki

chemiczne

Podział pożywek na podstawie

stopnia ich złożoności oraz

sposobu zaspakajania

potrzeb pokarmowych

mikroorganizmów:



proste - nazywane też zwykłymi lub podstawowymi,

stosowane do hodowli mikroorganizmów o niskich

wymaganiach odżywczych lub jako materiał

wyjściowy do sporządzania pożywek złożonych



złożone - zawierają dodatek substancji

wzrostowych, witamin, specjalnych źródeł węgla,

służą do hodowli mikroorganizmów o wysokich

wymaganiach.

Do tej grupy zalicza się podłoża selektywne oraz

różnicujące.

Podział pożywek w zależności

od celu badań i charakteru

hodowanych

mikroorganizmów

(stosujemy podłoża o różnej

konsystencji):



płynne (bulion, podłoża mineralne,

brzeczka)



stałe (zestalone agarem lub żelatyną)



półpłynne (zestalone małą ilością

agaru)

Typy podłoży bakteriologicznych w probówkach; Wzrost grzyba

Histoplasma capsulatum

a – w postaci skosu,

b – w postaci słupka

Do podstawowych

czynności w technice

mikrobiologicznej należą:



posiew (szczepienie) czyli

wprowadzenie badanego materiału

do odpowiedniej pożywki



przesiew (przeszczepianie) czyli

przenoszenie drobnoustrojów z

jednej pożywki na drugą

Przy posiewie do pożywki

płynnej wystarczy

zanurzyć w niej oczko,

natomiast przy posiewie

do pożywki zestalonej są

dwie możliwości:



wykonanie posiewu rysowego



wykonanie posiewu kłutego

Mikroskop stanowi

podstawowy przyrząd do

badania drobnoustrojów.

W zależności od sposobu

uzyskiwania powiększenia

wyróżniamy mikroskopy:



Świetlne (optyczne)



Elektronowe

W mikroskopach świetlnych

powiększenia uzyskuje się

dzięki układowi soczewek

optycznych. Należą do nich

następujące typy

mikroskopów:



Z jasnym polem widzenia



Z ciemnym polem widzenia



Do obserwacji w ultrafiolecie



Fluorescencyjny



Kontrastowo-fazowy



Konfokalny

Mikroskop optyczny zwykły ( z

jasnym polem widzenia )

składa się z dwóch

zasadniczych układów:



mechanicznego- statywu, stolika, tubusu

i dwóch śrub makrometrycznej i

mikrometrycznej



optycznego- obiektywu, okularu,

aparatu oświetlającego i lusterka

Części mechaniczne

Tworzą one rusztowanie dla

układu optycznego.



Podstawa-najczęściej w postaci ciężkiej metalowej

płyty, zapewnia stabilność przyrządowi i jest

wyposażona w oświetlacz (źródło światła).



Statyw-jest stalową konstrukcją łączącą wszystkie

części mikroskopu. Ma kształt kabłąka i stanowi

zarazem uchwyt do przenoszenia mikroskopu.



Tubus-jest to metalowa rura przystosowana w

górnej części do zakładania okularu lub nasadki, w

dolnej zaś zakończona tarczą obrotową zwaną

rewolwerem, w której znajdują się obiektywy.



Śruba makrometryczna umożliwia znalezienie

obrazu



Śruba mikrometryczna służy do ustawiania

właściwej ostrości obrazu

Części optyczne



Aparat oświetlający (ap.Abbego) znajduje się pod stolikiem i

kieruje promienie świetlne od źródła światła poprzez preparat

do obiektywu. Jest umieszczony w oprawce złączonej z

podstawą mikroskopu.



Oświetlenie preparatu



Obecnie mikroskopy mają wbudowane w podstawę

urządzenia oświetlające. Oświetlacze te są zaopatrzone w

przysłonę i matówkę.



Obiektywy są umieszczone na tarczy obrotowej. Mikroskop

optyczny ma przeważnie 3-5 obiektywów powiększających od

3 do 150 razy. Obiektywy są zbudowane z kilku lub kilkunastu

soczewek skupiających, sklejonych balsamem kanadyjskim,

umieszczonych w oprawce metalowej. Najbardziej zewnętrzna

soczewka nosi nazwę czołowej i jest narażona na uszkodzenia.



Obiektywy dzielimy na suche (powietrzne) oraz zanurzeniowe

(immersyjne).



Okulary są zbudowane z zespołu soczewek płasko-wypukłych i

powiększają na zasadzie lupy. Powiększają one od 2-30 razy.

Podstawowe parametry

charakteryzujące

mikroskop:



Powiększenie mikroskopu



Zdolność rozdzielcza



Odległość robocza



Przestrzeń robocza

Powiększenie mikroskopu jest iloczynem

powiększenia obiektywu i okularu.

Zdolność rozdzielcza mikroskopu określa,

jak blisko siebie mogą leżeć dwa punkty,

aby patrząc na nie przez mikroskop można

je było widzieć jako punkty oddzielne.

Zdolność rozdzielcza zależy wyłącznie od

obiektywu.

Odległość robocza jest to odległość

pomiędzy soczewką czołową obiektywu a

preparatem w momencie prawidłowego

ustawienia ostrości obrazu.

Przestrzeń robocza jest to przestrzeń

między soczewką czołową obiektywu a

preparatem w chwili najlepszego widzenia.

Mikroskop do oglądania w

ciemnym polu widzenia

Przy jego konstrukcji wykorzystano

tzw. efekt Tyndalla. Specjalnie

skonstruowany kondensor kieruje

promienie światła ukośnie do

powierzchni szkiełka przedmiotowego.

Promienie odbijają się od powierzchni

i powracają do kondensora, a pole

widzenia pozostaje ciemne. Gdy

promienie natrafią na komórki

drobnoustrojów, ulegają załamaniu lub

ugięciu i wskutek rozproszenia

wpadają do obiektywu. W efekcie

uzyskuje się jasno oświetlone punkty

na tle ciemnego pola.

Mikroskop do oglądania w

ultrafiolecie

Używając jako źródła światła

promieni ultrafioletowych (180-

400 nm), możemy oglądać

komórki o wielkości 0,1µm.

Soczewki w tym mikroskopie są

wykonane z kwarcu, gdyż

przepuszcza on promienie

ultrafioletowe. Ponieważ

promieniowanie to jest

niewidoczne, obrazy otrzymuje się

na kliszy fotograficznej lub na

ekranie telewizyjnym.

Mikroskop fluorescencyjny

Pewne substancje chemiczne

absorbują energię fal ultrafioletowych

i emitują ją jako fale widzialne

większej długości. Takie substancje

mogą mieć określone zabarwienie w

świetle normalnym i całkowicie inną

barwę w świetle ultrafioletowym.

Związki te nazywa się związkami

fluorescencyjnymi, a zjawisko –

fluorescencją. Jeśli wiec zawiesinę

bakterii nasyci się tymi związkami to

organizmy reagujące z tymi związkami

staną się fluoryzujące i będzie możliwa

ich obserwacja w mikroskopie, którego

pole widzenia jest oświetlone światłem

ultrafioletowym.

Mikroskop kontrastowo-fazowy

Jest szczególnie przydatny do badania

żywych komórek. Większość

mikroorganizmów jest bezbarwna i prawie

przeźroczysta, w skutek czego są one słabo

widoczne pod mikroskopem. Dlatego też

stosuję się różne metody barwienia

umożliwiające dostrzeżenie zabarwionych

komórek. Metoda kontrastu fazowego

umożliwia dokładną obserwację obiektów

bez konieczności ich barwienia.

Zasada działania polega na przesunięciu fali

światła o 180° między promieniami

przechodzącymi przez obserwowany

przedmiot a ugiętymi na preparacie. Pozwala

to na stworzenie kontrastu, który umożliwia

rozróżnienie szczegółów budowy oglądanych

obiektów.

Mikroskop konfokalny

Użycie światła laserowego

wprowadzonego do mikroskopu

od strony okularu skanuje pole

widzenia. Dzięki temu obraz

jest oświetlany punkt po

punkcie, wyłącznie w

płaszczyźnie ostrości obrazu.

Mikroskop ten ma duże

zastosowanie w badaniach

cytologicznych.

Mikroskop elektronowy

Tutaj rolę światła odgrywają

wiązki elektronów o bardzo małej

długości fali biegnących w

wysokiej próżni. Rolę soczewek

spełniają soczewki

elektrostatyczne lub

elektromagnetyczne.

Obraz przedmiotu może być

widoczny na specjalnym ekranie

fluorescencyjnym lub

fotografowany na płycie

fotograficznej przez wmontowany

w mikroskop aparat fotograficzny.

Powiększenia uzyskiwane sięgają

2 000 000 razy.

W zależności od kierunku

badań wykonuje się różne

rodzaje preparatów:



przyżyciowe, w których obserwuje

się drobnoustroje żywe



utrwalone i barwione, w których

drobnoustroje są martwe

Preparaty przyżyciowe

mogą być wykonywane w

postaci:



kropli spłaszczonej



kropli wiszącej

W przygotowaniu

preparatu wyróżnia się

trzy etapy:



przygotowanie preparatu



utrwalenie preparatu



barwienie preparatu

Można stosować barwienie



proste stosując jeden barwnik np.

błękit metylenowy lub fuksynę

zasadową



złożone stosując co najmniej dwa

barwniki, najczęściej metodą Grama

Document Outline