Obecność komórek
Obecność komórek
produkujących przeciwciała
produkujących przeciwciała
w zawiesinie splenocytów
w zawiesinie splenocytów
myszy (PFC).
myszy (PFC).
Agnieszka
Agnieszka
Czajka
Czajka
Obecność komórek
Obecność komórek
produkujących przeciwciała
produkujących przeciwciała
w zawiesinie splenocytów
w zawiesinie splenocytów
myszy (PFC).
myszy (PFC).
Agnieszka
Agnieszka
Czajka
Czajka
Antygen
Antygen
jest to każda substancja, która
jest to każda substancja, która
wykazuje dwie cechy:
wykazuje dwie cechy:
•
Immunogenność
Immunogenność
czyli zdolność wzbudzania
czyli zdolność wzbudzania
przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej
przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej
swoistej,
swoistej,
•
Antygenowość
Antygenowość
czyli zdolność do reagowania
czyli zdolność do reagowania
z przeciwciałami oraz TCR.
z przeciwciałami oraz TCR.
Antygeny grasiczozależne- wymagają udziału
Antygeny grasiczozależne- wymagają udziału
limfocytów T do wzbudzenia odpowiedzi,
limfocytów T do wzbudzenia odpowiedzi,
Antygeny grasiczoniezależne - nie wymagają
Antygeny grasiczoniezależne - nie wymagają
udziału limfocytów T w indukcji odpowiedzi.
udziału limfocytów T w indukcji odpowiedzi.
•
Antygeny monowalentne i poliwalentne.
Antygeny monowalentne i poliwalentne.
Odporność
Odporność
humoralna
humoralna
komórkowa
komórkowa
-Biorą udział limfocyty T i B
- Związana z wytwarzaniem
swoiście
reagujących z antygenem
przeciwciał,
mogących unieszkodliwiać
drobnoustroje
na drodze wielu różnych
mechanizmów.
- Powstają swoiście
uczulone
na dany antygen limfocyty
T,
mające zdolność
rozpoznawania
„odmienności” własnych
komórek i ich niszczenia.
Przemiany, jakim podlegają limfocyty
Przemiany, jakim podlegają limfocyty
podczas aktywacji:
podczas aktywacji:
•
Dojrzewanie limfocytów B w szpiku kostnym,
Dojrzewanie limfocytów B w szpiku kostnym,
–
Limfocyty proB,
Limfocyty proB,
–
Limfocyty preB,
Limfocyty preB,
–
Niedojrzałe limfocyty B,
Niedojrzałe limfocyty B,
–
Dojrzałe limfocyty B,
Dojrzałe limfocyty B,
•
Aktywacja limfocytów B
Aktywacja limfocytów B
–
BCR+kostymulanty(CD40,kompleksCD19/CD21
BCR+kostymulanty(CD40,kompleksCD19/CD21
/CD81/Leu13, CD22),
/CD81/Leu13, CD22),
•
Aktywacja limfocytów T
Aktywacja limfocytów T
–
Teoria dwóch sygnałów.
Teoria dwóch sygnałów.
Przeciwciała:
Przeciwciała:
Funkcja:
Funkcja:
Neutralizowanie
Neutralizowanie
wirusów
wirusów
i toksyn (IgG, IgA)
i toksyn (IgG, IgA)
Opsonizacja
Opsonizacja
Aktywacja
Aktywacja
dopełniacza
dopełniacza
Udział w fagocytozie
Udział w fagocytozie
ADCC – udział w
ADCC – udział w
cytotoksyczności
cytotoksyczności
1.Fragment Fab
2. Fragment Fc
3. Łańcuch ciężki
4. Łańcuch lekki
5. Miejsce wiązania
antygenu
6. Regiony zawiasowe
Test PFC (Plaque-Forming Cells
Test PFC (Plaque-Forming Cells
Assay).
Assay).
Wykrywanie komórek produkujących
Wykrywanie komórek produkujących
przeciwciała.
przeciwciała.
Zasada działania:
Zasada działania:
w
obecności
dopełniacza,
w
obecności
dopełniacza,
komórki
komórki
wytwarzające Ig
wytwarzające Ig
wywołują lizę erytrocytów, co
wywołują lizę erytrocytów, co
objawia się pojawieniem łysinek.
objawia się pojawieniem łysinek.
PFC
PFC
Bezpośrednie
Bezpośrednie
Pośrednie
Pośrednie
wykrywa komórki
wykrywa komórki
wykrywa komórki
wykrywa komórki
produkujące przeciwciała IgM
produkujące przeciwciała IgM
produkujące przeciwciała IgG
produkujące przeciwciała IgG
Materiał:
Materiał:
•
Myszy szczepu BALB / c
Myszy szczepu BALB / c
–
Immunizowane erytrocytami owcy
Immunizowane erytrocytami owcy
4% SRBC
4% SRBC
–
Nieimmunizowane (kontrolne - NaCl)
Nieimmunizowane (kontrolne - NaCl)
•
•
Mieszanina reakcyjna wypełniająca
Mieszanina reakcyjna wypełniająca
komory
komory
:
:
–
0,5 ml zawiesiny komórek śledzionowych
0,5 ml zawiesiny komórek śledzionowych
–
0,3 ml MEM
0,3 ml MEM
–
0,1 ml 20% SRBC w MEM
0,1 ml 20% SRBC w MEM
–
0,1 ml wyadsorbowanego dopełniacza świnki
0,1 ml wyadsorbowanego dopełniacza świnki
morskiej
morskiej
Metoda:
Metoda:
•
Immunizacja myszy wywołuje odpowiedz pierwotną, produkcję
Immunizacja myszy wywołuje odpowiedz pierwotną, produkcję
przeciwciał,
przeciwciał,
•
Kontakt z erytrocytami prowadzi do ich opłaszczania przez
Kontakt z erytrocytami prowadzi do ich opłaszczania przez
przeciwciała i aktywacji dopełniacza,
przeciwciała i aktywacji dopełniacza,
•
Aktywowany dopełniacz prowadzi do lizy erytrocytów i powstaniu
Aktywowany dopełniacz prowadzi do lizy erytrocytów i powstaniu
łysinek.
łysinek.
Podawanie
myszom
SRBC
4 dni
Usunięcie
śledziony
Dodanie
limfocytów do
ciekłej agarozy
zawierającej
SRBC
+
dopełniacz
na 1h, 37°C
Tworząca
się
łysinka
Jedna łysinka to
jedna komórka
produkująca
przeciwciała.
Wyniki:
Wyniki:
•
Spodziewane wyniki:
Spodziewane wyniki:
–
W populacji komórek śledzionowych pobranych od
W populacji komórek śledzionowych pobranych od
myszy immunizowanych SRBC
myszy immunizowanych SRBC
występują komórki
występują komórki
produkujące przeciwciała.
produkujące przeciwciała.
–
Odpowiedz immunologiczna u myszy
Odpowiedz immunologiczna u myszy
immunizowanej SRBC wykazuje
immunizowanej SRBC wykazuje
większą
większą
ilość
ilość
komórek produkujących przeciwciała, niż u myszy
komórek produkujących przeciwciała, niż u myszy
kontrolnej.
kontrolnej.
•
Uzyskane wyniki:
Uzyskane wyniki:
?
?
Obliczenia:
Obliczenia:
Ilość komórek produkujących przeciwciała
Ilość komórek produkujących przeciwciała
anty – SRBC na milion (10
anty – SRBC na milion (10
6
6
) śledzionowych
) śledzionowych
komórek limfatycznych.
komórek limfatycznych.
•
PFC/10
PFC/10
6
6
–
–
liczba komórek produkujących przeciwciała na milion
liczba komórek produkujących przeciwciała na milion
śledzionowych komórek limfatycznych
śledzionowych komórek limfatycznych
•
L śr
L śr
– średnia liczba łysinek produkowana w komorach
– średnia liczba łysinek produkowana w komorach
•
V śr
V śr
– średnia objętość mieszaniny wlanej do komór
– średnia objętość mieszaniny wlanej do komór
•
Gęstość
Gęstość
– gęstość komórek w mieszaninie reakcyjnej
– gęstość komórek w mieszaninie reakcyjnej
•
Żywotność
Żywotność
– żywotność komórek w zawiesinie
– żywotność komórek w zawiesinie
PFC/10
6
=
L śr * 10
6
Gęstość * żywotność * Vśr
Przykładowe wyniki:
Przykładowe wyniki:
Kontrola
Kontrola
SRBC
SRBC
Lśr – 0
Lśr – 0
Lśr – 80
Lśr – 80
Vśr – 0,1
Vśr – 0,1
Vśr – 0,13
Vśr – 0,13
gęstość – 10
gęstość – 10
8
8
gęstość – 10
gęstość – 10
6
6
żywotność – 0,93
żywotność – 0,93
żywotność – 0,75
żywotność – 0,75
PFC/10
PFC/10
6
6
»
»
0
0
•
PFC/10
PFC/10
6
6
= - 738,5
= - 738,5
- 778,6
- 778,6
- 813,3
- 813,3
- 848,0
- 848,0
- 940,48
- 940,48
PFC/10
6
823,78
1h
czas
PFC/10
6
SRBC
» 823,78
Literatura:
Literatura:
•
P.M. Lydyard, A. Whelan, M.W. Fanger
P.M. Lydyard, A. Whelan, M.W. Fanger
„Immunologia. Krótkie wykłady”
„Immunologia. Krótkie wykłady”
Wydawnictwo Naukowe PWN, Wydanie
Wydawnictwo Naukowe PWN, Wydanie
pierwsze, Warszawa 2006.
pierwsze, Warszawa 2006.
•
W. Ptak, M. Ptak, M. Szczepanik
W. Ptak, M. Ptak, M. Szczepanik
„Podstawy immunologii” Wydawnictwo
„Podstawy immunologii” Wydawnictwo
Lekarskie PZWL, Wydanie pierwsze,
Lekarskie PZWL, Wydanie pierwsze,
Warszawa 2008.
Warszawa 2008.