Podstawy teoretyczne chromatografii cieczowej, aparatura



Chromatografia (gr. chromatos =

barwa + grapho = pisze) to technika

analityczna lub preparatywna służąca

do rozdzielania lub badania składu

mieszanin związków chemicznych.



Termin chromatografia oznacza efekt

rozdziału (separacji) mieszaniny substancji

na jej składniki, obserwowany podczas

przepływu fazy ruchomej wzdłuż

powierzchni fazy nieruchomej. Cząsteczki

składników mieszaniny, które słabo

oddziałują z fazą nieruchomą, są szybciej

unoszone przez płynącą fazę ruchomą, zaś

cząsteczki przyciągane mocniej poruszają

się wolniej. Fazą ruchomą może być gaz

ciecz lub ciecz w stanie nadkrytycznym, zaś

fazą nieruchomą (stacjonarną) - ciecz, żel

lub porowate ciało stałe.



Pierwszego chromatograficznego

rozdziału mieszaniny barwników

organicznych dokonał w

Warszawie profesor Michaił Cwiet.

W oryginalnym opisie

doświadczenia datowanym na 23

kwietnia 1905 r. znajdujemy

informację, że użyto kolumny

szklanej wypełnionej

sproszkowanym węglanem

wapnia (kredy). Chloroformowy

roztwór barwników organicznych,

nanoszony na wierzchołek

kolumny, w miarę przechodzenia

przez warstwę kredy ulegał

rozdziałowi i poszczególne

składniki były widoczne w postaci

barwnych stref. Po wyjęciu słupka

kredy z kolumny można było go

podzielić i wyodrębnić

poszczególne składniki.

Klasyfikacja



Stan skupienia fazy ruchomej-

gazowa, cieczowa, fluidalna



Stan skupienia fazy stacjonarnej-

ciecz na nośniku lub ciało stałe

(adsorbent, wymieniacz jonowy lub

sito molekularne

Mechanizm



różnica w zdolności adsorpcyjnej

fazy stacjonarnej względem

różnych składników znajdujących

się w fazie ruchomej

(chromatografia adsorpcyjna);



różnica wielkości współczynnika

podziału składników

rozdzielanych między cieczą

umieszczoną na nośniku (w fazie

stacjonarnej) a fazą ruchomą

(chromatografia podziałowa);



różnica wielkości cząsteczek

separowanych składników

(chromatografia sitowa);



zatrzymywanie jonów na podłożu

jonitowym (chromatografia

jonowymienna).

Chromatografia cieczowa



Możliwość analizy większej ilości

związków niż za pomocą chromatografii

gazowej-ok.80%znanych związków

chemicznych



Warunkiem możliwości analizowania

jest rozpuszczalność związków



Mogą to być ciecze i ciała stałe, w tym

związki ulegające łatwo rozkładowi

termicznemu, polimery i związki

nieorganiczne



Chromatografię cieczową dzieli się na

kolumnową i planarną



Ch.kolumnowa tradycyjna jest

obecnie stosowana rzadko. Kolumna

ma długość 10-100cm i średnicę 1-

5cm. Czas analizy może wynosić do

kilkunastu godzin. Faza ruchoma

przepływa przez kolumnę pod

działaniem siły ciężkości. Do wad

należy również mała rozdzielczość i

duże zużycie fazy ruchomej.



Chromatografia kolumnowa zwykła

nie ma obecnie praktycznego

znaczenia wanalizie chemicznej i jest

stosowana zwłaszcza do oczyszczania

i rozdzielania składników mieszanin

na skalę preparatywną



Do analizy stosuje się znacznie

bardziej udoskonalony wariant-

wysokosprawną chromatografię

cieczową

Wysokosprawna chromatografia

cieczowa (HPLC - high

performance liquid

chromatography)



Uniwersalna metodą analityczna, stosowana

głównie do analiz złożonych próbek,

zwłaszcza zawierających nielotne,

wielkocząsteczkowe związki chemiczne, w

szczególności substancje biologicznie czynne.

Skład fazy ciekłej i rodzaj fazy stacjonarnej

jest uzależniony od składu badanych próbek

oraz typu oddziaływań wykorzystywanych do

osiągnięcia separacji ich składników.

Aparatura



Analizę wykonuje się za pomocą

chromatografów cieczowych



Fazę ruchomą pompuje się (po filtracji i

odgazowaniu) przez kolumnę



Analizowaną próbkę nastrzykuje się na

szczyt kolumny



Składniki rozdzielone po wyjściu z kolumny

są wykrywane przez detektor



Sygnał z detektora jest zapisywany przez

rejestrator

Podstawowe części

chromatografu to:



zbiornik fazy ruchomej



filtr



pompa



manometr



dozownik



kolumna



termostat



detektor



wzmacniacz



rejestrator, komputer



automatyczny dozownik

Pompy



Powodują przepływ fazy ruchomej w

sposób ciągły, odtwarzalny i z optymalną

prędkością



Dobre pompy powinny się

charakteryzować stałym przepływem fazy

ruchomej z możliwością regulacji,

odpornością chemiczną materiału pompy,

małą objętością wewnętrzną,

bezpulsacyjnym przepływem, możliwością

uzyskania ciśnień roboczych do 35MPa

Istnieją dwie kategorie układów

pompujących:



stałociśnieniowe



stałoprzepływowe

Pompy stałociśnieniowe



Są rzadko stosowane. Są to pompy

wyporowe oraz z tłokami o różnej

średnicy z napędem pneumatycznym



Mają prostą konstrukcję, brak pulsacji

ciśnień



Wadą jest możliwość zmian

przepływu fazy ruchomej

Pompy stałoprzepływowe



Istnieje kilka typów:

strzykawkowe-pracują

bezpulsacyjnie, mała ilość fazy

ruchomej zużywana w jednym

cyklu pracy oraz tłokowe-

najpowszechniej stosowane



Powszechnie stosowane

Pompy tłokowe



Jeden lub dwa tłoki



Tłoki przesuwają się w cylindrach o

małej objętości (0,03-1ml)



Można uzyskać przepływ w granicach

0,1-30ml/min, wytwarzane ciśnienia

do 50MPa



Wadą może być pulsacja cieczy

Kolumny



W zależności od wielkości próby

istnieją mikrokolumny, kolumny

analityczne i preparatywne



Do celów analitycznych zwykle

stosowane są kolumny analityczne



Najczęściej są to rurki ze stali

nierdzewnej o wypolerowanej

powierzchni wewnętrznej

Kolumny



Długość od 5 do 35cm



Średnica wewnętrzna 4,6mm



Długość zależy od średnicy ziaren

wypełnienia. Im ziarno mniejsze tym

kolumna krótsza.



Zamknięte z dwóch stron filtrami i

łącznikami do połączenia z

dozownikiem i detektorem

Wypełnienia kolumn



wypełnienia krzemionkowe-używane

w większości analiz



wypełnienia wykorzystujące żywice

porowate

Wypełnienia kolumn



o dużych ziarnach z głębokimi szerokimi

porami



powierzchniowo porowate, z cienką

warstwą adsorpcyjną na nieprzenikliwym

rdzeniu



o bardzo małej średnicy ziaren i

mikroporach w całej masie ziarna

wykorzystywane jako adsorbenty, matryca

dla faz chemicznie związanych,

wypełnienia dla chromatografii sitowej

Fazy chemiczne związane na

bazie krzemionki



z niepolarnymi grupami-

chromatografia w odwróconym

układzie faz



z polarnymi grupami-chromatografia

w normalnym układzie faz



z grupami jonowymiennymi



z grupami optycznie czynnymi



Napełnianie kolumn wymaga

profesjonalnego oprzyrządowania i

dobrego przygotowania



Często stosowane są kolumny z

wypełnieniem



Można je napełniać techniką suchą i

mokrą (sporządzenie zawiesiny

wypełnienia w rozpuszczalniku o

gęstości zbliżonej do wypełnienia)

Detektory

Dobry detektor powinien

charakteryzować się: dużą

czułością, szerokim zakresem

liniowości wskazań, małą

objętością, niewrażliwośią na

zmiany temperatury i prędkości

przepływu fazy ruchomej,

łatwością obsługi

Detektory do HPLC dzielimy na

dwa rodzaje:



pomiar właściwości

charakterystycznej dla próbki



różnicowy pomiar właściwości

charakterystycznej dla próbki i fazy

ruchomej

Detektory

spektrofotometryczne UV

działają na zasadzie absorpcji

promieniowania UV



pracujące przy jednej długości fali

(254nm)



pracujące w bliskim nadfiolecie i

zakresie widzialnym z płynnym

nastawianiem mierzonej długości fali



detektory z matrycą diod

Detektor

spektrofluorymetryczny



czuły wobec związków wykazujących

właściwości fluorescencyjne



Detektor selektywny



łączy się go z detektorem

absorpcyjnym

Detektor refraktometryczny



po detektorze

spektrofotometrycznym najczęściej

używany



mierzy w sposób ciągły różnice

współczynników załamania czystej

fazy ruchomej i eluentów z kolumny



detektor uniwersalny



wrażliwy na zmiany temperatury

Document Outline