Molekularne podstawy pośredniej diagnostyki pasożytów krwi i chłonki.

Molekularne podstawy

rozpoznawania antygenu

przez limfocyty B.



Aby limfocyt B mógł spełnić swoją funkcję musi zostać

aktywowany. Do rozpoczęcia tego procesu niezbędne jest

bezpośrednie rozpoznanie antygenu przez

kompleks

receptora BCR l

ub pośrednio poprzez kontakt z innymi

komórkami APC, wówczas następuje przekazanie sygnału

przez fragment błonowy receptora do wnętrza komórki.

Receptor ten s

kłada się z:



Podjednostki wiążącej antygen –

cząsteczki przeciwciała (

IgD, IgM,

IgG,

IgA

lub

IgE

)

wbudowanego w błonę.



Podjednostki

przekazującej sygnał – heterodimeru

Ig-

α/

Ig-

(

CD79) wraz

z cytoplazmatyczną

sekwencją ITAM.

Prezentacja antygenu i

aktywacja limfocytów B.



We wczesnym etapie przekazania sygnału, dochodzi do

aktywacji

kinaz tyrozynowych

fosfolipazy C.

Aktywacja

kinaz powoduje fosforylację tyrozyn w obrębie sekwencji ITAM

oraz fragmentów receptora Igα i Igβ. Do ufosforylowanych

cząsteczek ITAM przyłączają się kolejne białka z różnych

szlaków biorące udział w przekazywaniu sygnału do wnętrza

komórki.



Ostateczny efekt działania na receptor jest regulowany przez

wiele cząsteczek powierzchniowych. Do najważniejszych

cząsteczek kostymulujących

należą CD40 oraz kompleks

CD19/CD21/CD81.

Na tym etapie limfocyt B łączy się z

limfocytem Th.

Cząsteczki kostymulujące pozwalają na

wytworzenie

synapsy immunologicznej

i wzajemnej

współpracy obu komórek. Wówczas, prócz wydzielaniu dużej

ilości cytokin może dojść do

prezentacji antygenu

limfocytowi T.

Wtedy pobudzony limfocyt T dodatkowo

stymuluje komórkę do aktywacji lub wydzielania przeciwciał.

Zmiana klasy

produkowanych

immunoglobulin.



W pierwszym etapie limfocyt B prezentuje limfocytowi

Th antygen który rozpoznał. Następnie dochodzi do

połączenia dwóch komórek i wytworzenia

synapsy

immunologicznej.

W wyniku tego połączenia oraz

wydzialanych przez limfocyt Th cytokin (np. IL-4, IL-5,IL-

10), komórka przekazuje limfocytowi B bodziec do

zmiany klasy przeciwciał z IgM i IgD na IgG, IgA lub IgE.

Następuje odpowiedź humoralna, polegająca w głównej

mierze na produkcji przeciwciał, obejmuje m.in.:

Aktywowanie układu dopełniaczy zabijającego antygen.

Opsonizację związanego patogenu (ułatwia fagocytozę

przez makrofagi).

Inaktywacje toksyn i umożliwienie ich fagocytozy.

STRATEGIA ZMIENNOŚCI

ANTYGENOWEJ

Trypanosoma brucei

Główny antygen powierzchniowy

afrykańskiego świdrowca jest dimerem

glikoproteinowym zwanym

zmienną

glikoproteiną powierzchniową

(VSG).

Świdrowce zawierają więcej niż 1000

różnych genów VSG, które różnią się

wyraźnie w sekwencji. W kolejnych stadiach

następuje zmiana „płaszcza antygenowego”,

co uniemożliwia skuteczną odpowiedź

immunologiczną oraz wytworzenie

szczepionki przeciw zakażeniu.

Hamowanie aktywacji

układu immunologicznego

-Schistosoma



Schistosoma haematobium wytwarza

substancje, które działają immunosupresyjne na

limfocyty T gospodarza oraz takie, które

prowadzą do degranulacji jego komórek

tucznych.

Produkcja IL-10 czyli cytokiny

przeciwzapalnej hamuje wytwarzanie cytokin

prozapalnych takich, jak interferon-gamma, IL-2,

IL-3, TNF-α.

Tym samym

hamując reakcje

immunologiczną

przeciwko temu pasożytowi.

Kamuflaż antygenowy

Schistosoma

Larwy Schistosoma mansoni wnikają przez skórę i

wędrują do płuc, a następnie do układu krążenia. Zanim

wejdą do płuc, larwy te otaczają się

warstwą

glikolipidów antygenów grupowych krwi ABO i

cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej

(MHC), pochodzących od gospodarza.

Prawdopodobnie do powierzchni larw przywr

przytwierdza się wiele innych cząsteczek gospodarza.

Płaszcz z białek gospodarza maskuje antygeny pasożyta

i w efekcie organizm pasożyta jest postrzegany przez

system immunologiczny żywiciela jako własny.

Diagnostyka pośrednia

pasożytów krwi i chłonki.



Aglutynacja bezpośrednia



Odczyny immunoenzymatyczne



Odczyn immunofluorescencji

pośredniej

Aglutynacja bezpośrednia



Aglutynacja- reakcja, w wyniku której

aglutynogen jest wiązany przez aglutyniny, co

powoduje powstanie dużych, wytrącających się

kompleksów.



Antygenem wykorzystywanym do odczynów

aglutynacyjnych bezpośrednich jest zawiesina

zabitych i utrwalonych pasożytów.



Pod wpływem przeciwciał zawartych w badanej

surowicy antygen aglutynuje, wytwarzając

charakterystyczny wzór.



Wykrywanie

Leishmania donovani, Trypanosoma

brucei

Odczyn pośredni.



Pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych

w surowicy.



Używa się antygenu rozpuszczalnego pasożyta do

opłaszczania fazy stałej np. zagłębień płytek

hemaglutynacyjnych, aby związać na opłaszczonej

powierzchni przeciwciała występujące w badanej surowicy.



Po zakończeniu inkubacji z próbką badanej surowicy,

dodaje się surowicy przeciwglobulinowej sprzężonej z

enzymem (peroksydazą lub fosfatazą alkaliczną).



W końcowym etapie stosuje się układ indykatorowy reakcji

enzymatycznej, dodając mieszaniny substratu enzymu i

nadtlenku wodoru.



Gdy reakcja jest dodatnia powstaje barwny produkt

końcowy w ilości proporcjonalnej do stężenia oznaczanego

komponentu surowicy.

Odczyn wychwytu

przeciwciał.



Fazę stałą okrywa się preparatem surowicy odpornościowej przeciw

globulinom: G, M, A, lub E.



Po zakończeniu inkubacji z próbką badanej surowicy dodaje się

kompleks antygenu pasożyta z przeciwciałem wyznakowanym

enzymem.



W końcowym etapie stosuje się układ indykatorowy reakcji

enzymatycznej, dodając mieszaniny substratu enzymu i nadtlenku

wodoru.



Gdy reakcja jest dodatnia powstaje barwny produkt końcowy w

ilości proporcjonalnej do stężenia oznaczanego komponentu

surowicy.



Ma większą swoistość wyników niż odczyn pośredni

Odczyn immunoflorescencji

pośredniej.



Umożliwia wykrycie przeciwciał obecnych w

płynach ustrojowych, najczęściej w surowicy

krwi, przez inkubację badanego płynu z

antygenem szkiełkowym pasożyta.



Przeciwciała związane w czasie inkubacji z

antygenem wykrywa się za pomocą surowicy

przeciwglobulinowej sprzężonej z

fluorochromem (zazwyczaj z izotiocyjaninem

fluorosceiny wykazującym charakterystyczne

świecenie podczas oglądania preparatu pod

mikroskopem w świetle ultrafioletowym).

Modyfikacje

ELISA

czyli płytkowy test immunoenzymatyczny fazy stałej –jeden z

najpowszechniej stosowanych testów w badaniach biomedycznych,

zarówno naukowych, jak i diagnostycznych.



Podstawą testów ELISA jest tworzenie kompleksów immunologicznych

między antygenem a przeciwciałem (rozpoznającym specyficznie

antygen)



Służy on do wykrycia i ilościowej oceny określonych antygenów (np.

białek, antygenów bakteryjnych, wirusowych, pasożytniczych,

hormonów, leków) lub przeciwciał (np. przeciwciał antywirusowych) w

badanym materiale z użyciem specyficznych dla danego antygenu

przeciwciał lub specyficznych dla danego przeciwciała antyprzeciwciał

skoniugowanych (wyznakowanych) z odpowiednim enzymem.

SAFA



Jest pośrednim testem antygenowym, który

umożliwia

obiektywnie ustalić antygen, będący

przyczyną choroby.



Pozwala wyeliminować problem związany z

barwieniem.

Jako substratu dla antygenu używa

się sztucznej matrycy z płyty zawierającej octan

celulozy. Wyniki testu są odczytywane za

pomocą fluorometru.

Wykorzystanie testów biologii

molekularnej w różnicowaniu

pasożytów krwi.



Nested

PCR-

stosowane są dwa różne primery, użycie

pierwszej pary prowadzi do powielenia łatwo dostępnych

segmentów DNA lub RNA, których fragmenty bywają niekiedy

jednakowe dla różnych gatunków pasożytów, natomiast

kontynuowanie reakcji za pomocą drugiej pary starterów

zawęża amplifikację do fragmentów swoistych już tylko dla

jednego gatunku



RADP-

do amplifikacji używa się arbitralnie dobranych

primerów, zawierających zazwyczaj poniżej 20 nukleotydów w

łańcuchu, które bez trudu odszukują komplementarne

sekwencje w badanym DNA, przytwierdzając się w wielu

miejscach nici kwasu, oddzielonych fragmentami o różnej

długości zależnej od gatunku pasożyta. W etapie wydłużania

łańcuchów DNA powstają fragmenty nici o różnej długości,

które podczas rozdziału elektroforetycznego zamplifikowanego

materiału wędrują z różną prędkością, dając w efekcie wzór

prążków charakterystyczny dla danego gatunku.

Document Outline