Wyniki badań dotyczące charakterystyki, adhezji, migracji i inwazyjności komórek raka prostaty PC-3 oraz różnych linii komórkowych raków okrężnicy

Okres półtrwania:

U bakterii – kilka minut

U eukariontów – kilka godzin

Około 80%

całkowitego

RNA

Drobnocząsteczkowy RNA
(około 16% całkowitego RNA),
który dzieli się na trzy
kategorie:

a) małe jądrowe RNA (zwane
też U RNA)

b) małe jąderkowe RNA

c) małe cytoplazmatyczne RNA

RNA z kategorii a i b pełnią
funkcję podczas dojrzewania
innych cząsteczek RNA

Transportująco-

informacyjny RNA

Cząstki te wyglądają

jak tRNA przyłączony

do mRNA i dodają

krótkie etykietki

peptydowe do białek,

które zostały

nieprawidłowo

zsyntetyzowane,

wyznaczając je do

degradacji

Zasada

Wiązani

e fosfo-

diestrow

Koniec 5’

Koniec

5’

Koniec

3’

Koniec 3’

Wiązani

e fosfo-

diestrow

Nici

macierzyste

DNA Macierzysty

Prymaza

Gyraza

W miejscu replikacji (ori) następuje

asocjacja białek wiążących się do

swoistych sekwencji dwuniciowego

DNA; u

E. coli

sekwencja oriC wiąże

białko dnaA. Tworzy się kompleks

składający się ze 150-200 pz DNA i

multimerów białka wiążącego DNA.

Prowadzi to do miejscowej

denaturacji i rozplecenia

dwupasmowej helisy przyległego

regionu DNA, bogatego w pary AT.

Powstaje krótki region

jednoniciowego DNA

U bakterii gyraza

zmienia lopologię

DNA likwidując

superskręty.

Krytycznym etapem

jest dostarczenie

helikazy DNA, która

stopniowo rozplata

DNA. Powstają

widełki replikacyjne

Do utrzymania

widełek

replikacyjnych

niezbędne jest

dołączenie do

kompleksu

inicjujacego tzw.

białek

stabilizujących

jednoniciowy DNA

(SSB – ang. Single-

strand binding

proteins)

Do rozpoczęcia syntezy

DNA potrzebny jest

starter (primer) ponieważ

polimeraza DNA zależna

od DNA nie ma zdolności

rozpoczyania syntezy

novo. Może tylko

wydłużać istniejący

łańcuch. U

prokaryota

starterem jest krótki

łańcuch

oligonukleotydowy (2-10

nukleotydów)

syntetyzowany przez

PRYMAZĘ. Niektóre

prymazy budują starter

wyłącznie z

rybonukleotydów, inne

wykorzystują zarówno

rybo-jak i

deoksyrybonukleotydy

Substratami zużywanymi w procesie biosyntezy są deoksyrybonukleotydy

trifosforanowe. Poza starterem potrzebne są jony Mg2+, i polimeraza DNA.

Wszystkie polimerazy DNA wykorzystują nić DNA jako matrycę, wymagają

startera z wolną grupą 3’-OH, wydłużają łańcuch w kierunku 5’-3’,

przyłączając kolejne nukleotydy do wolnej grupy 3’-OH, wykazują

aktywność egzonukleazową 3’-5’. Zasadnicza część łańcucha

syntetyzowana jest przez polimerazę III. Polimeraza III umiejscowiona w

widełkach rozpoczyna syntezę nici DNA, wydłużając starter zsyntetyzowany

przez prymazę. Nić prowadząca jest syntetyzowana w sposób ciągły przez

jedną cząsteczkę polimerazy, która nie odłącza się od matrycy aż do

zakończenia replikacji.

Nić opóźniona syntetyzowana

jest we fragmentach

zawierających po około 1000

nukleotydów (fragmenty

Okazaki).

Jedna cząsteczka polimerazy III

wbudowuje około 1000

nukleotydów/sek.

Aktywność 3’-5’ nukleazowa

sprawdza usuwa natychmiast

każdy nieprawidłowy nukleotyd

Polimeraza III jest dimerem, w

którym jedna podjednodtka

syntetyzuje nić prowadzącą, a

druga opóźnioną.

Polimeraza I jest

enzymem

szczególnym, Jedna

cząsteczka białka

enzymatycznego ma

trzy aktywności

enzymatyczne –

transferazową i dwie

egzonukleolityczne.

Może wydłużać

łańcuch DNA i

odcinać nukleotycy

w kierunku 3’ 5’

oraz

5’ 3’. Enzym usuwa

startery i wypełnia

przerwy pomiędzy

fragmentami

Okazaki. Aktywność

3’ 5’ usuwa

pojedyncze

nulleotydy a

aktywnośc

nukleazowa 5’ 3’

zarówno pojedyncze

nukleotydy jak i

oligonukleotydy. Ta

aktywność ma

znaczenie w

usuwaniu starterów.

Uczestniczy w

naprawie błędów,

usuwa uszkodzwnia

np. dimery tyminy

Charakterystyczną cechą replikacji DNA eukariotycznego jest mnogość miejsc inicjacji.

Wynika to z konieczności przyspieszenia tego procesu (chromosom eukariotyczny jest

około 1000 razy większy od genomu prokariotycznego). W chromosomie Drosophila

występuje ponad 6000 widełek replikacyjnych na 1 cząsteczkę DNA. W miejscach

inicjacji replikacji występują swoiste, powiarzające się sekwencje nukleotydowe

określane jako sekwencje replikujące się autonomicznie – ARS (autonomously

replicating sequences). Miejsca ARS rozpoznawane są przez kompleks rozpoznający

mioejsce inicjacji replikacji złożony z 8 białek. Do ARS przyłączają się białka, które

powodują miejscowy rozpad podwójnej helisy i powstanie widełek replikacyjnych (m.

inn. helikaza, białko stabilizujące pojedynczą nić DNA, zwane białkiem replikacyjnym A

– RPA (replication protein A). Główną rolę w replikacji odgrywają polimerazy a i d.

Polimeraza a pełni też funkcję prymazy. Polimerazy b i e to enzymy naprawcze.

Polimeraza g replikuje mitochondrialny DNA

Fragmenty Okazaki – długość ok..200 nukleotydów

Łączenie fragmentów Okazaki przebiega

inaczej niż u prokaryota (polimeraza d

nie ma aktywności egzonukleazowej 5’-

3’). Po dotarciu polimerazy d do

zsyntetyzowanego wcześniej fragmentu

Okazaki możliwe są dwa mechanizmy:

pierwszy polega na działaniu

endonukleazy, która odcina starter

syntetyzowany przez polimerazę a –

drugi na usunięciu tego startera przez

odpowiednie egzonukleazy. Polimeraza d

wydłuża łańcuch o brakujący fragment a

ligaza łączy oba końce.

Odrębnym problemem jest skracanie się

chromosomów w kolejnych rundach

replikacyjnych

Telome

DNA zawarty w chromosomach eukariotycznych, w odróżnieniu od DNA

prokaryota

, ma charakter liniowy. Replikacja liniowego DNA stwarza

problem nieistniejący u

prokaryota.

Nić prowadząca może być wydłużana

do końca matrycy, natomiast nić opóźniona jest syntetyzowana w

odwrotnym kierunku w wielu fragmentach i wymaga powtarzalnej

syntezy starterów. Polimeraza DNA może wydłużać łańcuch

polinukleotydowy jedynie w kierunku 5’ 3’. Usunięcie ostatniego

startera pozostawia puste miejsce. Podczas kolejnych replikacji powstaje

coraz krótszy łańcuch DNA. Utrata znacznej części sekwencji

telomerowych podczas kolejnych rund replikacyjnych prowadzi do

niestabilności chromosomów i śmierci komórki

Telomery wyznaczają końce chromosomu i umożliwiają komórce

odróżnienie prawdziwych zakończeń od końców nienaturalnych,

powstających w wyniku pękania chromosomu (pęknięcia muszą

zostać naprawione). Telomerowy DNA człowieka utworzony jest

z setek kopii powtórzonego motywu 5’- TTAGGG-3’, z krótkim

wystającym odcinkiem jednoniciowym na końcu 3’ dwuniciowej

cząsteczki DNA

Promotor dla:

Operon Trp

tRNA dla Tyr

CONSENSUS

Promotory bakteryjne mają
długość około 40
nukleotydów. Na tym
obszarze są dwa
konserwatywne regiony –
region -35 i region -10,
bogaty w pary AT. Sekwencja
w regionie -10 ułatwia
dysocjację między pasmem
kodującym i niekodującym.
Region -35 rozpoznawany
jest przez podjednostkę
sigma (s

) polimerazy RNA

W komórkach ssaków

W komórkach ssaków sygnały transkrypcyjne są bardziej złożone. W
proksymaqlnym regionie promotora umiejscowione są dwa typy sekwencji
sygnalnych – jedna określa miejsce gdzie ma się zacząć transkrypcja, inne
determinują jak często ma zachchodzić ten proces.

Najbliżej miejsca startu, w regionie około -15 -30 występuje kaseta TATA (TATA box)
–odpowiednik regionu -10 u prokaryota. Przyłącza się tu białko wiążące TATA (TBP)
(TATA binding protein), które z kolei wiąże inne białka regulatorowe asocjujące z
TBP. Takie oddziaływania zapewniają wierność inicjacji transkrypcji.

W regionie odległym o około 40 -110 nukleotydów od miejsca startu transkrypcji (
-40 – 110) można odnaleźć ramki CG i CAAT wiążące białka regulatorowe. Mutacje w
tych regionach 10-20x zmniejszają częstość startu transkrypcji.

Istotą transkrypcji jest przepisanie informacji

zawartej w DNA na sekwencję
nukleotydową RNA. Przejściowo powstaje
hybryda DNA-RNA. Nić DNA, która ulega
transkrypcji na cząsteczkę RNA nazywa się
nicią matrycową a druga – nicią kodującą.
Nić kodująca ma taką samą sekwencję jak
pierwotny transkrypt (z wyjątkiem tego, że
ma T zamiast U). Dana nić w dwuniciowej
cząsteczce DNA może służyć jako nić
matrycowa dla niektórych genów, a dla
innych być nicią kodująca. Informacja na
nici kodującej jest odczytywana w kierunku
3’ 5’. mRNA w komórkach
prokariotycznych może ulegać translacji w
takiej postaci w jakiej został
zsyntetyzowany. Transktypt może
obejmować produkt kodowany przez kilka
przyległych do siebie genów

Organizmy prokariotyczne mają tylko jedną

polimerazę RNA (5 podjednostek: dwie a
wiążą białka regulatorowe, b -tworzy
wiązania fosfodiestrowe, b’ – wiąże
matrycę DNA, s

(sigma)

Niespecyficzne wiązanie holoenzymu
polimerazy i wędrówka w kierunku
promotora

Tworzenie ścisłego kompleksu enzymu z
promotorem

Utworzenie kompleksu otwartego

Zainicjowanie syntezy RNA (pierwszym jest
zazwyczaj nukleotyd purynowy)

Wydłużenie mRNA o około 8 nukleotydów

Uwolnienie podjednostki s (sigma)

Podczas
tworzenia kilku
pierwszych
wiązań
fosfodiestrowyc
h powstający
transkrypt nie
jest mocno
związany.
Większość
produktów
inicjacij usuwana
jest na etapie
krótkich
oligonukleotyów
(2-9 reszt)

Transkrybowane regiony matrycy DNA zawierają
sygnały „Stop” Sygnał taki wysyła fragment DNA
zawierający dwa symetryczne regiony bogate w GC,
które po przepisaniu na transkrypt mają tendencję
do przybierana struktury dwuniciowej połączonej
pętlą (struktura spinki do włosów). Za nimi
występuje region bogaty w A (4-8 nukleotydów).
Jakie ma to znaczenie dla zakończenia transkrypcji?

Polimeraza RNA osiągnąwszy pierwszy region
bogaty w CG zwalnia lub zatrzymuje się, ponieważ
wysoka stabilność par GC stwarza trudności w
rozdzieleniu nici DNA. Taka pauza lub zwolnienie
daje czas na uwolnienie transkryptu od matrycy i
utworzenie dwuniciowej struktury w transkrypcie.
Tym samym następuje osłabianie wiązań w
potrójnym kompleksie: matrycaDNA-RNA-enzym.

W miejccu, gdzie w matrycy występuje A, w RNA
występuje U. Wiązanie AU jest najsłabszym z
możliwych. Nowo powstały RNA odłącza się od
matrycy a następnie od polimerazy RNA.

Uwolniona nić matrycowa ponownie łączy się z nicią
kodującą, odtwarzając podwójną helisę. Rdzeń
polimerazy (bez podjednostki s

) ma mniejsze

powinowactwo do podwójnej helisy niż do
jednoniciowego DNA i dlatego uwalnia się z matrycy.
Podjednostka s

ponownie przyłącza się do rdzenia

enzymu tworząc holoenzym, który poszukuje na
nowo miejsc promotorowych

Struktura

„spinki

włosów”

RNA powstający w procesie transkrypcji (transkrypt), na ogół różni się istotnie od RNA zdolnego do

pełnienia funkcji biologicznych. Pierwotny transkrypt podlega dalszym przekształceniom.

W literaturze można spotkać określenie SPLICING czyli składanie. Proces ten polega na fragmentacji

transkryptu, usuwaniu lub dodawaniu pewnych sekwencji nukleotydowych, modyfikacji zasad i reszt rybozy

Cząsteczki mRNA podlegają niewielkiej modyfikacji lub nie ulegają jej

wcale. Prekursory tRNA i rRNA podlegają następującym modyfikacjom:

1. Produkt transkrypcji może być prekursorem kilku cząsteczek RNA.

Cząsteczki tRNA i r RNA wytwarzane są przez rozcięcie i modyfikacje
produktów transkrypcji.

2. Niektóre łańcuchy RNA zostają wydłużone przez dobudowanie

dodatkowych nukleotydów. Tak powstaje na przykład
charakterystyczna dla wszystkich tRNA 3’-końcowa sekwencja CCA (o
ile nie pochodzi z transkrypcji)

3. Niektóre zasady purynowe i pirymidynowe oraz niektóre reszty rybozy

podlegają różnym modyfikacjom (np. metylacja niektórych zasad i
grup –OH rybozy w pozycji 2’). Poprzez zmianę sposobu wiązania
uracylu z rybozą , UMP przekształca się w
pseudourydynomonofosforan (MP). (węgiel 1’ rybozy połączony jest z

atomem w/ęgla w pozycji 5 uracylu)

Modyfikacje (etapy 1-4), które zachodzą podczas dojrzewania tRNA

Tyr

pierwotnego transkryptu u E. coli i zmodyfikowane zasady (5)
występujące w dojrzałym tRNA

Endonukl

eaza

RNaza D

usuwa

kolejno 7

nukleotyd

ów

RNaza P

4-tiourydyna

RNaza D

usuwa

dwa

nukleotyd

Pseudourydyna

Około 170

nukleotydów

-Metyloguanozyna

Izopentenyloadenozyna

podlega intensywnej modyfikacji. Proces obejmuje

modyfikację końców 5’ i 3’ oraz wycięcie i dobudowanie
pewnych sekwencji nukleotydowych.

KONIEC 5’ jest modyfikowany poprzez dobudowanie
„czapeczki” w następujący sposób: jedna reszta
fosforanowa nukleotydu 5’ końcowego jest hydrolitycznie
odłączana. Powstały nukleotyd difosforanowy wchodzi w
reakcję z GTP, od którego odłącza się pirofosforan. W ten
sposób guanina staje się zasadą stanowiącą szczyt
czapeczki (jest ona dołączona niezgodnie z kierunkiem
transkrypcji). Azot tej guaniny ulega metylacji w pozycji N

Kolejne metylacje dotyczą C

’rybozy. Dawcą –CH

jest S-

adenozynometionina. Czapeczka stabilizuje cząsteczkę
mRNA i chroni 5’ koniec przed fosfatazami i nukleazami

KONIEC 3’ jest modyfikowany przez poliadenylację . Niektóre
transkrypty pierwotne zawierają po stronie 3’ setki
nukleotydów nieonecnych w dojrzałym mRNA. Są one
odłączane przez swoistą nukleazę rozpoznającą sekwencję
AAUAAA. Polimeraza poli (A) dołącza w to miejsce około 250
reszt. Donorem jest ATP.

WYCINANIE INTRONÓW przez endonukleazy. Długość
większości intronów 50-10000 nukleotydów. Mają one
charakterystyczne zakończenia: początek GU i koniec AG.
Enzymy nukleolityczne rozpoznają je jako miejsca
splicingowe intronu.

Pseudourydyna

Zablokowa

transkrypc

Odblokowa

transkrypcj

Operon laktozowy

obejmuje trzy geny
strukturalne (z, y, a)
kodujące enzymy
uczestniczące w
metabolizmie laktozy
(b-galaktozydazę,
permeazę,
transacetylazę) oraz
sąsiadujący gen
regulatorowy (i).

A) Pod nieobecność

induktora represor
będący produktem
genu i wiąże się z
operatorem i hamuje
transkrypcję

B) Induktor (laktoza)

wiąże się z
represorem i obniża
powinowactwo
represora do
operatora.
Oddysocjowanie
kompleksu represor-
induktor od
operatora prowadzi
do transkrypcji
genów
strukturalnych

B-galaktozydaza

Permeaza

(białko

transportow

Niewidocz

ny tu gen

a dla

transacety

lazy

Document Outline