Zakład Genetyki Medycznej
Terapia genowa
Michał Pietrusiński
Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Łódź 2006
Zakład Genetyki Medycznej
Terapia genowa
Michał Pietrusiński
Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Łódź 2006
Zakład Genetyki Medycznej
Technologia klasycznej terapii genowej
1. Geny:
• Mogą zostać wprowadzone do komórek gospodarza drogą
bezpośrednią lub pośrednią
• Mogą zintegrować się z genomem gospodarza lub pozostać poza
genomem
2. Główne podejścia wprowadzania genów w terapii genowej do komórek
gospodarza:
• Transfer ex vivo
• Transfer in vivo
Zakład Genetyki Medycznej
Transfer ex vivo
1. Celem uniknięcia reakcji autoimmunologicznej komórki pobiera się od
gospodarza
2. Transfer sklonowanych genów do komórek hodowlanych
3. Selekcja zrekombinowanych komórek na podłożu wzrostowym in vitro
4. Wprowadzanie zrekombinowanych komórek z powrotem do organizmu
gospodarza
5. Przykłady: komórki skóry; podobieństwo do transplantacji komórek np.
przeszczep szpiku kostnego
Zakład Genetyki Medycznej
Transfer in vivo
1. Transfer sklonowanych genów bezpośrednio do komórek gospodarza
2. Stosowany w przypadku, gdy komórek nie można hodować in vitro np.
komórki nerwowe lub komórek nie można z powrotem efektywnie
wprowadzać do organizmu gospodarza
3. Konieczność stosowania wektorów:
• wirusowych
• nie-wirusowych
Zakład Genetyki Medycznej
Zakład Genetyki Medycznej
Podstawy
1. Efektywny transfer sklonowanych genów do komórek, celem wywołania
ekspresji na możliwie wysokim poziomie
2. Wielkość wprowadzanego fragmentu bardzo ograniczona – zasadność
stosowania cDNA flankowanego silnymi sekwencjami promotorowymi
3. Po transferze, geny mogą zintegrować się z genomem gospodarza lub
pozostać niezintegrowane (episomy)
Zakład Genetyki Medycznej
Geny zintegrowane z chromosomem
1. Zalety:
• Replikacja obcego genu wraz chromosomem podczas podziału komórki
• Wszystkie komórki potomne zawierają sklonowany gen
• Łatwość uzyskania długoterminowej ekspresji sklonowanego genu
• Przykłady: tkanki złożone z komórek aktywnie dzielących się – komórki
macierzyste
2. Wady:
• Insercja sklonowanych genów zachodzi w dowolnych miejscach (różnych
dla poszczególnych komórek)
• Ekspresja na zmiennym poziomie na skutek umieszczenia genu w silnie
skondensowanym regionie heterochromatynowym
• Śmierć komórki
• Indukcja procesu karcenogenezy – aktywacja onkogenu, inaktywacja genu
supresorowego lub apoptotycznego
Zakład Genetyki Medycznej
Geny niezintegrowane z chromosomem
• Problem z uzyskaniem wysokiej ekspresji wprowadzonego genu – nie
wszytkie komórki potomne odziedziczą klon
• Konieczność wielokrotnego powtarzania terapii
• Aplikacja techniki do komórek nie dzielących się
Zakład Genetyki Medycznej
Zakład Genetyki Medycznej
Wektory wirusowe
1. Onkoretrowirusy
2. Adenowirusy
3. Wirusy adeno-associated
4. Wirusy HSV (Herpes simplex-opryszczka)
5. Lentiwirusy
Zakład Genetyki Medycznej
Porównanie wybranych cech wektorów
wirusowych
cecha
Onkoretro-
wirusy
Adenowirus
y
Adeno-
associated
Lentiwirusy
Liposomy
Wielkość
wstawki
7-7.5kb
>30kb
4.0kb
7-7.5kb
Bez
ograniczeń
Integracja do
chromosomu
Tak
Nie
Tak/Nie
Tak
Znikoma
Czas ekspresji
in vivo
Krótki
Krótki
Długi
Długi
Krótki
Stabilność
Dobra
Dobra
Dobra
?
B.dobra
Droga
transferu
Ex vivo
Ex vivo/in
vivo
Ex vivo/in
vivo
Ex vivo/in
vivo
Ex vivo/in
vivo
Stężenie
(cząstek/ml)
>
>
>
>
Nieograniczo
ne
Łatwość
hodowli
Łatwa
Łatwa
Trudna
?
Łatwa
Odpowiedź
immunologicz
na
Niewielka
Silna
?
Niewielka
Wcale
Aspekty
bezpieczeńst
wa
Mutageneza
Odp.
Immunol.
Toksyczność
Odp.
Immunol.
Toksyczność
Mutageneza
Wcale
10
8
10
11
10
12
10
8
Zakład Genetyki Medycznej
Mechanizm działania wektorów
retrowirusowych
Zakład Genetyki Medycznej
Mechanizm działania wektorów
adenowirusowych
Zakład Genetyki Medycznej
Nie-wirusowe wektory stosowane w terapii
genowej
1. Liposomy
2. Bezpośredni transfer/bombardowanie cząsteczkami – np. komórki mięśniowe
3. Endocytoza zależna od receptora
Zakład Genetyki Medycznej
Liposomy
Zakład Genetyki Medycznej
Endocytoza
Zakład Genetyki Medycznej
Terapia genowa a choroby dziedziczne
1. Najłatwiejszy cel: choroby monogenowe dziedziczące się w sposób
autosomalny recesywny bo:
• Najczęstsze mutacje prowadzą do utraty funkcji
• Chorzy maja zmutowane oba allele – całkowity lub prawie całkowity zanik
ekspresji genu
• Heterozygoty posiadając ekspresje na poziomie 50% to asymptomatyczni
nosiciele
• W wielu przypadkach ekspresja genu na bardzo małym poziomie może
przywrócić fenotyp prawidłowy
• W przypadku chorób autosomalnych dominujących mutacja utraty funkcji
w jednym locus chromosomowym (50%) może prowadzić do silnych
objawów chorobowych
Zakład Genetyki Medycznej
Konsekwencje spadku poziomu stężenia
HGPRT
Poziom aktywności HGPRT (w % w
stosunku do normalnego)
Fenotyp
>60
Normalny
8 – 60
Neurologicznie normalny, hiperurikemia
1,6 – 8
Neurologicznie z problemami
1,4 – 1,6
Zespół Lescha – Nyhana, inteligencja w
granicach normy
<1,4
Klasyczny zespół Lescha – Nyhana,
opóźnienie umysłowe
Zakład Genetyki Medycznej
Pierwszy eksperyment – niedobór deaminazy
adenozyny (ADA)
1. 14.09.1990 – 4 letnia dziewczynka
2. ADA
• Degradacja kwasów nukleinowych,
• Enzym „housekeeping”
• Brak ADA upośledza limfocyty T i prowadzi do ostrego złożonego
niedoboru odporności (SCID)
• Gen małych rozmiarów, dobrze poznany
• Limfocyty T łatwe do hodowli in vitro – transfer ex vivo
• Kontrola regulacji ekspresji na niskim poziomie
Zakład Genetyki Medycznej
Zakład Genetyki Medycznej
β-talasemia – zaburzenie syntezy łańcuchów
globiny w hemoglobinie
1. Gen β-globiny (HBB )
• Gen niewielkich rozmiarów, dobrze poznany
2. Dziedziczenie autosomalne recesywne
3. Skomplikowane mechanizmy kontroli sterujące ekspresją genów
• Poziom β-globiny musi być równy poziomowi α-globiny
• Przewaga β-globiny na rzecz α-globiny prowadzi do ujawnienia fenotypu α-
talasemii
Zakład Genetyki Medycznej
Rodzinna hipercholesterolemia
1. Defekt receptorów LDL normalnie syntetyzowanych w wątrobie -
miażdżyca
2. Dziedziczenie autosomalne dominujące
3. 50% chorych heterozygotycznych mężczyzn umiera przed 60 r. życia
4. Osobniki homozygotyczne umierają we wczesnym dzieciństwie
5. Hepatocyty
• Odporne na infekcje retrowirusami
• Łatwe do hodowli in vitro – transfer ex vivo
• Mogą być wprowadzane bezpośrednio przez system żył łączących jelita z
wątrobą
• Po zastosowaniu terapii stosunek LDL/HDL ulega zmniejszeniu i
utrzymuje się przez długi czas
• Zabieg wiąże się z wycięciem fragmentu wątroby
Zakład Genetyki Medycznej
Mukowiscydoza
1. Dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny
2. Wiąże się z defektem transportu jonów chlorkowych w komórkach
nabłonkowych
3. Ekspresja genu CFTR pierwotnie zachodzi w płucach
4. Jedyna możliwość to transfer in vivo – komórki płuc nie dają się
hodować in vitro
5. Pierwsze próby z użyciem wektorów adenowirusowych w 1993r
• Choroby płuc
• Konieczność ścisłej kontroli ilości dawki adenowirusów
6. Użycie liposomów jako wektorów o wiele bezpieczniejsze, jednak
efektywność transferu znacznie mniejsza