METODY   IZOLACJI   

KOMÓREK UKŁADU     

IMMUNOLOGICZNEGO

Ćwiczenie   
1

 

 

Materiał  biologiczny stosowany 

do izolacji 

komórek układu 

immunologicznego:

- 

krew obwodowa

- płyny ustrojowe (wysięk otrzewnowy)
- tkanki lite (np.  migdałki, węzły chłonne)
- narządy (np. wątroba, płuca)

 

 

Izolacja komórek układu 
immunologicznego                             
 z  tkanek litych:

- 

rozdrobnienie mechaniczne na małe fragmenty

- trawienie skrawków tkanki za pomocą 
enzymów np. kolagenaza, pronaza, DNA-za

- oddzielenie zawiesiny komórek od fragmentów 
tkanki przesiewając przez odpowiednie sita lub 
filtry

 

 

 

I     Pobieranie i przechowywanie krwi 

do izolacji komórek układu 

immunologicznego:

Krew obwodowa:

 

 

Antykoagulanty:

-  heparyna w stężeniu 20-50 IU/ml

                -  cytrynian sodu 3,8 -5 % 
                 -  wersenian sodu (EDTA) 4 mM

 

Płyny do płukania:

 

-  płyn  Ringera,  płyn  PBS  (buforowana  fosforami  sól 

fizjologiczna) 

  

Podłoża odżywcze

:

 

-  zawierają  podstawowe  aminokwasy  i  białka  oraz  sole 
mineralne, witaminy, mikroelementy, 

-  czasem  wzbogacone  dodatkiem  10-20%  surowicy  cielęcej, 
płodowej cielęcej lub mieszanej homologicznej lub autologicznej.

- płyn Parkera,   płyn Eagla, płyn Hanksa

- podłoże MEM,  podłoże RPMI 1640

 

 

II     Metody 
izolacji 

1)  Metoda sedymentacji

 

 wykorzystuje zjawisko  zróżnicowanej szybkości 

opadania poszczególnych rodzajów krwinek w 
zawiesinie

- czas inkubacji od 1 do 2 godz. w temp. 37

0

C

- dodanie roztworu dekstranu wielkocząsteczkowego 
(Dextran 500),                     3% żelatyny w NaCL lub 
1,2% alkoholu poliwinylowego przyspiesza proces 
(czas inkubacji 25 min)

limfocyty 
monocyty
granulocyty

erytrocyt
y

 

 

2)  Izolowanie komórek w gradientach 
gęstości

 

  

wykorzystuje różnice pomiędzy gęstością względną 

użytego gradientu a wielkością i masą izolowanych 
komórek
 gradienty gęstości:

- posiadają odpowiednio dobraną gęstość 

względna, 

-  posiadają niską lepkość, 

- są izoosmotyczne względem krwi, 

- nie osłabiają żywotności komórek 

- nie przenikają  do  wnętrza komórek  

- są  łatwe do wypłukania z oczyszczonej 

zawiesiny         

komórkowej.

 

 

2.1.   Izolacja limfocytów w gradiencie 
jednostopniowym

Ficoll,  Isopaque, 

Hypaque

(1,077 g/ml)

wirowanie

Erytrocyty i 
granulocyty

Supernatant

Interfaza z 

komórkami 

jednojądrzastymi

 

 

Supernat
ant

Interfaza 1 

z komórkami 

jednojądrzastymi

Interfaza 2   

            z 

granulocyta

mi

Erytroc
yty

• Gradisol G (Mieszanina Uropoliny i 
dekstranu) 1,115 g/ml

• Histopaq 1,119 g/ml  i Histopaq 1,077 g/ml
• Percoll  1,076 g/ml  i Percoll 1,064 g/ml

wirowanie

2.2.   Izolacja limfocytów w gradiencie 
dwustopniowym

 

 

3.  Metody  
adherencyjne

- wykorzystują zdolność przylegania do powierzchni szkła i plastiku 
niektórych komórek układu immunologicznego (szczególnie 
monocytów, granulocytów i limfocytów B)

- stosuje się kolumny wypełnione watą nylonową, watą szklaną, 
cząsteczkami wielocukru                (np.. Sephadexem D-10) lub 
płytki  poliestyrenowe Petriego (m.in. do rozdziału limfocytów B i T)

60 min 
inkubacji w 
temp. 37

0

C

limfocyty

monocy
ty

30 min 
inkubacji           
      w temp. 
4

0

C

monocy
ty

limfocyty

 

 

4. Metody z 

zastosowaniem 

immunoabsorbentów

Immunoabsorbenty:

-  Kulki  szklane,  kulki  plastikowe,  cząsteczki 
agarozy, 

cząsteczki 

poliakrylamidu 

opłaszczone 

przeciwciałami 

skierowanymi 

przeciwko antygenom powierzchniowym danej 
populacji komórek 

 

 

Metoda immunoadsorbcji komórek na 

fazie stałej (panning)

- wykorzystywana do rozdziału limfocytów T na 
subpopulacje CD4 i CD8

 

 

4. Izolacja komórek z zastosowaniem 

kulek paramagnetycznych (magnetic 

beads) 

- służą do uzyskania czystych populacji komórek z wstępnie 
uzyskanej mieszaniny

Odpłukane czyste 

eozynofile

Inkubacja 

granulocytów      

                    z 

przeciwciałami   

                      

anty-

neutrofilowymi

Oddzielenie 

populacji 

neutrofilów     

           w polu 

magnetyczny

m

kuleczki 

magnetyczne 

opłaszone 

przeciwciałami     

        anty-

neutrofilowymi

 

 

5. Izolacja za pomocą fluorescencyjnie  

aktywowanego                      „sortera” 

komórek (FACS) (cytometr przepływowy)

 

 

 

6. Izolacja limfocytów T przy 

pomocy zastosowania testu 

rozetowego 

 

Testy rozetowe zaliczane są do grupy biologicznych 

metod izolacji

 

 

Ocena żywotności i czystości wyizolowanych 
komórek

Żywotność

- oceniana metodą przeżyciowego barwienia błękitem 
trypanu, który ma zdolność wnikania jedynie do wnętrza 
martwych komórek (Norma ok. 100%)

Czystość

- oceniana w preparacie wybarwionym metodą Giemsy 
(licząc 100 kolejnych  komórek i wyrażając liczbę badanych 
komórek w procentach)

 

 

cdn…