Cezary Cybulski
REAKCJA ŁAŃCUCHOWA
POLIMERAZY CZASU
RZECZYWISTEGO
Cezary Cybulski
REAKCJA ŁAŃCUCHOWA
POLIMERAZY CZASU
RZECZYWISTEGO
Real-time PCR
Analiza reakcji PCR w trakcie jej
przebiegu i/lub po jej ukończeniu za
pomocą:
sond molekularnych wyznakowanych
barwnikami fluorescencyjnymi
barwników fluorescencyjnych łączących
się z DNA
Real-time PCR - aparatura
termocykler:
blok grzejno-chłodzący
karuzela z próbkami grzana/chłodzona
powietrzem
wzbudzanie fluorescencji
Lampa halogenowa/xenonowa
Laser argonowy
detekcja
Matryca CCD
Fotopowielacz (PMT)
Real-time PCR - aparatura
Real-time PCR – skąd zmiany
fluorescencji?
wygaszanie fluorescencji gdy cząsteczki są
w bliskim sąsiedztwie (FRET), a narastanie
gdy odległość między nimi wzrasta
Narastanie fluorescencji podczas łączenia
się się niektórych barwników z
dwuniciowym DNA, a wygaszanie podczas
rozdziału DNA na pojedyncze nici
Real-time PCR - barwniki
barwniki fluorescencyjne:
FAM (fluoresceina)
JOE
VIC
HEX
ROX
CY3
CY5
inne
wygaszacze (quenchers):
◦
TAMRA
◦
DABCYL
◦
BHQ 1, 2, 3
◦
NFQ
◦
QSY7
◦
Guanina
barwniki dsDNA:
◦
SYBR Green
◦
LC Green I i Plus
◦
SYTO9
◦
EvaGreen
Real-time PCR – do czego?
Analizy ilościowej - ekspresji genów
Analizy jakościowej – wykrywanie
zaburzeń sekwencji DNA
Wykrywanie zmian DNA – typy sond
Hydrolizujące (hydrolysis probes)
TaqMan Probes – SNP Genotyping Assay
Hybrydyzujące (hybridization probes)
Guanine-quenching probe (SimpleProbes)
BHQProbes
Unlabled-Probes (dsDNA dye)
HybProbes
Molecular Beacons
Molecular Scorpions
LUX primers (Guanine-quenching probe)
TaqMan SNP Wykrywanie zmian DNA
Dwie sondy :
6FAM
5’-NNNNNN
A
NNNNNN-3’ MGB + NFQ
VIC
5’ –NNNNNN
G
NNNNNN-3’ MGB + NFQ
Dwa specyficzne primery
Aktywność exonukleazy 5’->3’
polimerazy
TaqMan SNP Wykrywanie zmian DNA
A mp lifi c a t io n C u r ve s
Cycles
40
39
38
37
36
35
34
33
32
31
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
19.155
17.655
16.155
14.655
13.155
11.655
10.155
8.655
7.155
5.655
4.155
2.655
1.155
TaqMan SNP Wykrywanie zmian DNA
TaqMan SNP Genotyping
6FAM
Homozygoty
AA
VIC
Homozygot
y GG
6FAM
VIC
Heterozygoty
A
G
Guanine Quenching probes
Sondy, których barwniki
fluorescencyjne są wygaszane przez
Guaninę
(powtórzenia GG lub GGG lub GGGG)
SimpleProbes (Roche) - Proste sondy
Guanine Quenching - zasada
Badamy polimorfizm
A
/G
Sonda
FAM
- 5’
C
nnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
Dwa primery – produkt ~ 50 -100 pz
Polimeraza bez aktywności exonukleazy 5’-
3’
Asymetryczny PCR
Guanine Quenching - zasada
hybrydyzacja
FAM
- 5’Cnnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
3’xxxxxxxxx
GGG
nnnnnn
A
nnnnnnxxxxxxxxxxxxx
5’
Guanine Quenching – melting analysis
hybrydyzacja
SONDA-TARGET
niska
fluorescencja
denaturacja
SONDA-TARGET
flurescencja
rośnie
Pełna
denaturacja
SONDA-TARGET
Fluorescencja
na wyższym
poziomie
Tm 63
0
C
Guanine Quenching - zasada
Sonda komplementarna-produkt PCR
Tm=63
0
C
FAM
- 5’Cnnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
3’xxxxxxxxx
GGG
nnnnnn
A
nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’
Mismatch sonda-produkt PCR
Tm=56
0
C
FAM
- 5’Cnnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
3’xxxxxxxxxxxx
GGG
nnnnnn
G
nnnnnnxxxxxxxxxxx
5’
M e lt in g C u r ve s
Temperature (°C)
75
70
65
60
55
50
45
40
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
37.677
36.177
34.677
33.177
31.677
30.177
28.677
27.177
25.677
24.177
22.677
Guanine Quenching - zasada
Homo AA
Homo GG
Het AG
M e l t i n g P e a k s
Temperature (°C)
75
70
65
60
55
50
45
-(
d
/d
T
)
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
0.489
0.189
-0.111
-0.411
-0.711
-1.011
-1.311
-1.611
-1.911
-2.211
-2.511
Kontrola zerowa
LUNA Probes –
sondy nieznakowane
Badamy polimorfizm
A
/G
Sonda 5’nnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
SYTO9, LC GREEN, Eva GREEN
Dwa primery – produkt ~ 50 -100 pz
Polimeraza bez aktywności exonukleazy
5’-3’
Asymetryczny PCR
Co wybrać?
Jeżeli nie lubimy się zastanawiać nad
metodyką, zależy nam na czasie i
mamy fundusze : TaqMan (1,1
zł/próbkę)
Jeżeli lubimy główkować , mamy
trochę więcej czasu i mniej
funduszy:
SimpleProbes – 40 gr/próbke
LUNAProbes - < 40gr/próbkę