„METODY WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI ORAZ OCENY LEKOWRAŻLIWOŚCI DROBNOUSTROJÓW”

Odpowiednio zorganizowane i

wyposażone laboratorium

mikrobiologiczne powinno:

•

wykryć czynnik etiologiczny,

•

zidentyfikować go (przynajmniej do poziomu

gatunku),

•

określić jego wrażliwość na antybiotyki.

Podstawowe zasady, które muszą

być zachowane przy pobieraniu

próbek do badania

mikrobiologicznego:

•

materiał musi pochodzić z

odpowiedniego

miejsca

•

próbki powinny być pobierane w odpowiednim

czasie

•

badana próbka musi mieć odpowiednią

objętość

•

należy używać odpowiednich

pojemników

podłoży

•

czas transportu

materiałów musi być jak

najkrótszy

i w odpowiednich warunkach,

•

pojemnik z materiałem powinien być

oznakowany

(czas pobrania materiału, rozpoznanie, leczenie)

METODY

BEZPOŚREDNIE:

•

bakterioskopia bezpośrednia,

•

hodowla- metoda klasyczna

(

inkubacja 18-24h

)

•

wykrywanie antygenów

bakteryjnych testami lateksowymi,

•

wykrywanie DNA lub RNA

drobnoustroju (metody biologii

molekularnej).

METODY POŚREDNIE:

•

określenie poziomu swoistych

przeciwciał w surowicy lub płynach

ustrojowych,

•

próby biologiczne na zwierzętach

(rzadko).

BAKTERIOSKOPIA

BEZPOŚREDNIA

•

Cel

– wykazanie obecności bakterii w badanym

preparacie, dostarczenie informacji na temat kształtu

komórek bakteryjnych i ich charakterystycznych

układów.

•

est stosunkowo proste i tanie, nie jest jednak metodą

czułą

materiał musi zawierać minimum 10

komórek

bakteryjnych

w 1 ml.

•

Z próbek materiałów od chorych sporządza się rozmazy

preparaty świeże i utrwalone, barwione i nie barwione.

•

Metody barwienia stosowane w mikrobiologii klinicznej

można podzielić na 2 podstawowe grupy:

•

barwienie negatywne

, gdzie barwi się tło, a

drobnoustroje pozostają bezbarwne (tusz chiński,

nigrozyna), preparat nie jest uprzednio utrwalony,

•

barwienie pozytywne

, wymagające użycia barwników

mających powinowactwo do drobnoustrojów, nie

barwiących tła, preparat utrwalony.

Inny podział obejmuje barwienie

•

proste

(np. błękitem metylenowym) oraz

•

złożone

(np. metoda Grama, Ziehl-Nielsena).

Najczęściej używaną w mikrobiologii klinicznej metodą

barwienia jest

metoda Gram

, której

astosowanie

wprowadziło bardzo istotny z klinicznego punktu

widzenia podział drobnoustrojów na Gram(+) i Gram(-)

•

bakterie

Gram(+)

barwią się fioletem krystalicznym na

kolor granatowy

•

drobnoustroje

Gram(-)

wybarwiają się tylko

barwnikiem kontrastowym (fuksyna zasadowa lub

safranina) na różowo.

METODY HODOWLANE

•

Są kosztowniejsze, ale dużo czulsze niż metody

mikroskopowe

•

Materiał zawierający 10² – 10³ CFU/1 ml wykazuje wzrost

bakterii po posiewie na podłoża stałe, a 10 CFU w 1 ml

można wykryć po namnożeniu na podłożach płynnych.

•

Badany materiał należy posiać na odpowiedni zestaw

podłoży stałych i płynnych. Rodzaj stosowanych podłoży

zależy od rodzaju badanego materiału i przewidywanej

obecności w nim drobnoustrojów.

•

Posiew materiałów na podłoża stałe dokonywany jest przy

użyciu wyżarzonej uprzednio

ezy

, którą nabiera się jałowo

materiał zawierający bakterie. Najczęściej stosowana jest

technika

posiewu redukcyjnego

(posiew z izolacją).

Podział

podłoży

hodowlanych

•

namnażające

– bogate podłoża nie zawierające

żadnych związków hamujących wzrost drobnoustrojów,

•

selekcyjno-różnicujące

- wzbogacone są

substancjami o działaniu hamującym na określone

grupy drobnoustrojów i jednocześnie ułatwiającym

wzrost innym.

Inny podział podłoży

bakteriologicznych:

•

proste (woda peptonowa),

•

złożone:

płynne (bulion cukrowy, bulion krwawy),

2. s

tałe

wzbogacone (agar krwawy, agar czekoladowy),

wzbogacone wybiórcze (agar krwawy z fioletem

azydkiem),

wybiórczo-różnicujące (MacConkey’a,

Chapmana,

Sabourauda

Identyfikacja drobnoustroju

polega na:

•

określeniu wyglądu kolonii,

•

przygotowaniu preparatu mikroskopowego,

•

określeniu właściwości biochemicznych,

•

określeniu właściwości antygenowych,

•

określeni

zjadliwości drobnoustroju.

KOLONIA:

•

zbiór komórek wyrastających na podłożu stałym,

widoczny gołym okiem. Przyjmuje się, że jedna

kolonia odpowiada jednej komórce bakteryjnej lub

grzybiczej

•

CECHY:

kształt,

wielkość,

brzeg,

powierzchnia,

struktura,

wyniosłość ponad powierzchnię,

kolor,

przejrzystość,

konsystencja,

zapach,

zawieszalność.

Właściwości biochemiczne

•

Fermentacyjne, enzymatyczne (proteaza, lipazy lecytynazy,

koagulaza,

katalaza

itp.)

stanowią

niejednokrotnie

koagulaza,

katalaza

itp.)

stanowią

niejednokrotnie

podstawową wskazówkę w rozpoznawaniu różnych gatunków

drobnoustrojów.

•

Szczególną przydatność ma zdolność fermentowania różnych

węglowodanów i alkoholi; wytwarzanie indolu, siarkowodoru

•

Wybrane cechy metaboliczne określa się za pomocą tzw.

szeregów biochemicznych

przygotowanych zgodnie z

recepturą we własnym zakresie lub przy wykorzystaniu

gotowych zestawów.

•

W skład zestawu może wchodzić kilka lub kilkanaście

substratów do oceny zdolności ich rozkładu przez bakterie.

Testy z substratami

chromogennych enzymów

•

po dodaniu zawiesiny badanego szczepu

substrat jest rozkładany przez enzymy

bakteryjne. W konsekwencji powstaje produkt

barwny lub taki, który uzyskuje zabarwienie

po dodaniu specjalnego odczynnika.

•

Testy te charakteryzują się 95% czułością i

swoistością oraz umożliwiają identyfikację

bakterii w czasie krótszym niż 4h.(

Neisseria

meningitidis, Enterococcus

spp. )

Analiza chromatografii gazowej

•

zasada

chromatografii

polega

uzyskaniu

zasada

chromatografii

polega

uzyskaniu

równowagi absorpcyjnej składników w 2 fazach –

ruchomej

(obojętny gaz pełniący rol

nośnika) i

stacjonarnej

(płynna).

•

Pary badanej substancji wprowadza się do strumienia

gazowego nośnika; poszczególne składniki badanej

próbki

ulegają

rozdzieleniu,

zależnie

próbki

ulegają

rozdzieleniu,

zależnie

powinowactwa do fazy płynnej i opuszczają

wykorzystywaną w badaniu kapilarową kolumnę.

•

Porównanie czasu, w którym składniki opuszczają

kolumnę (

czas retencji

) z innymi czasami retencji

pozwala na identyfikacje badanego składnika.

•

Uzyskane chromatogramy porównuje się ze znanymi

standardami.

Badanie w

łaściwości

antygenowych

•

pozwala na

różnicowanie wielu bakterii na

gatunki i serotypy.

•

Służą do tego celu m.in. metody serologiczne,

np. aglutynacja szkiełkowa, precypitacja

probówkowa i inne.

Odczyn precypitacji

•

reakcja przeciwciało/antygen - pod wpływem

swoistego przeciwciała łączącego się z cząsteczką

antygenu

powstają

kompleksy

antygen-

antygenu

powstają

kompleksy

antygen-

przeciwciało, które łącząc się w większe agregaty

wytrącają się z roztworu w postaci precypitatu.

•

Reakcja ta jest wysoce swoista, ale czułość jest

mniejsza niż np. reakcji aglutynacji.

•

Najprostszą metodą precypitacji jest zmieszanie

surowicy i antygenu w probówce. W obecności

swoistych przeciwciał na dnie probówki obserwuje

się charakterystyczny osad.

Odczyn aglutynacji

•

reakcja

przeciwciało/zawiesina

antygenów

reakcja

przeciwciało/zawiesina

antygenów

powstające kompleksy antygen-przeciwciało łącząc

się (zlepiając) w większe agregaty powodują

mętnienie pierwotnie jednorodnej zawiesiny.

•

Uzyskany wynik wyraża się w postaci

miana

, tzn.

największego

rozcieńczenia

przeciwciał

największego

rozcieńczenia

przeciwciał

powodującego aglutynację.

•

Ma zastosowanie w diagnostyce m.in. salmonellozy,

listeriozy

mononukleozy

oraz

wykrywania

listeriozy

mononukleozy

oraz

wykrywania

Rotawirusów oraz czynnika reumatoidalnego.

Odczyn wiązania dopełniacza

•

stosuje się najczęściej do wykrywania swoistych

przeciwciał.

•

Dopełniacz

zdolność

wiązania

Dopełniacz

zdolność

wiązania

immunokompleksów. Wolny dopełniacz powoduje

lizę krwinek czerwonych, które jako antygen

związały na swojej powierzchni przeciwciała

Jeśli

dopełniacz

zostanie

związany

przez

dopełniacz

zostanie

związany

przez

immunokompleksy nie wystąpi hemoliza.

•

Stosowany jest w diagnostyce toksoplazmozy,

cytomegalii, odry, różyczki, brucelozy, zakażeń

wirusem typu herpes, duru brzusznego, durów

rzekomych oraz zakażeń o etiologii

Mycoplasma.

TESTY LATEKSOWE

•

Zasada działania testów oparta jest o reakcję

aglutynacji

zachodzącej

układzie

antygen-

aglutynacji

zachodzącej

układzie

antygen-

przeciwciało. Antygen znajduje się w badanym

materiale klinicznym, zaś drugim elementem tego

układu są monoklonalne przeciwciała przeciwko

określonemu antygenowi (np. otoczce) opłaszczone

na nośniku (cząsteczki lateksu).

•

Dostępne na rynku testy lateksowe pozwalają nie

tylko na stwierdzenie obecności drobnoustrojów, ale

także na ich identyfikację.

•

Mimo

iż

testy

lateksowe

przyśpieszają

Mimo

iż

testy

lateksowe

przyśpieszają

ukierunkowują

badanie

mikrobiologiczne,

nie

ukierunkowują

badanie

mikrobiologiczne,

nie

zwalniają z wykonania klasycznej diagnostyki metod

hodowli.

TEST ELISA

•

pozwala na jakościowe i ilościowe oznaczanie

przeciwciał (we wszystkich klasach) i antygenów w

materiale biologicznym

•

party

jest

zasadzie

chromatografii

party

jest

zasadzie

chromatografii

powinowactwa

znany czynnik (antygen lub

immunoglobulinę) absorbuje się na stałym podłożu.

Do powstałej w ten sposób fazy stałej przyłącza się

swoisty antygen lub przeciwciała (jeśli są obecne w

badanej próbce). Nie związany materiał usuwa się

przez płukanie. Po wypłukaniu zbędnego materiału i

dodaniu odpowiedniego dla enzymu substratu

oznacza się spektrofotometrycznie intensywność

reakcji barwnej, która jest odzwierciedleniem

rozkładu substratu przez enzym. Na tej podstawie

wnioskuje

się

zawartości

poszukiwanych

wnioskuje

się

zawartości

poszukiwanych

czynników w badanym materiale (antygenów lub

przeciwciał).

Olbrzymia rola, wysoka czułość i

swoistość

testów ELISA

doprowadziła

do wykonania testów fabrycznych,

wysoko zautomatyzowanych, a nawet

skomputeryzowanych.

Testy ELISA wykorzystuje się w

diagnostyce np. toksoplazmozy,

cytomegalii, różyczki, żółtaczki zakaźnej,

Chlamydia

, wirusów

RSV

Rotawirusów

Helicobacter pylori

IMMUNOBLOTTING

•

może być zastosowany do analizy antygenów

białkowych,

także

charakteryzowania

białkowych,

także

charakteryzowania

przeciwciał

•

ykorzys

tywany

często do wykrywania swoistych

przeciwciał w surowicy chorych

•

jest rozszerzeniem badań serologicznych, które

wykazują obecność swoistych antygenów różnych

patogenów, a także swoiste przeciwciała reagujące z

charakterystycznymi antygenami białkowymi tych

patogenów

•

dużym powodzeniem jest stosowany w diagnostyce

zakażeń wirusowych, bakteryjnych i zakażeń

pierwotniakami

(np.

wirusem

cytomegalii,

pierwotniakami

(np.

wirusem

cytomegalii,

Helicobacter pylori, Campylobacter, Clostridium,

Escherichia coli, Staphylococcus oraz Toxoplasma

gondii

)

METODY BIOLOGII

MOLEKULARNEJ

•

ecyzja o ich wdrożeniu do diagnostyki jest

uzależniona od czułości, swoistości oraz

szybkości wykrywania określonego patogenu w

stosunku do metod konwencjonalnych

•

wyróżnia się metody oparte na analizie

lipopolisacharydów i kwasów tłuszczowych,

białek oraz kwasów nukleinowych

•

materiale klinicznym pobranym od chorego

poszukuje się charakterystycznych dla danego

drobnoustroju

węglowodorów,

białek

czy

drobnoustroju

węglowodorów,

białek

czy

unikatowych sekwencji DNA lub RNA

SONDY GENETYCZNE

•

przygotowanie

materiału

denaturacja

przygotowanie

materiału

denaturacja

(oddzielenie nici DNA)

•

dodanie

znakowanej

sondy

hybrydyzacja

dodanie

znakowanej

sondy

hybrydyzacja

(rozpoznanie i łączenie się sondy z odszukanymi w

materiale

klinicznym

sekwencjami

materiale

klinicznym

sekwencjami

komplementarnymi)

•

usunięcie nie związanej sondy

•

wykrycie związanej sondy (obecnie używane sondy

nie są w stanie wykryć pojedynczej matrycy w

badanym materiale, ponieważ pojedynczy produkt

hybrydyzacji nie pozwala na otrzymanie czytelnego

sygnału. Dlatego w celu zwielokrotnienia sygnału

stosuje się szereg reakcji opierających się na

znakowaniu sondy produktem, który w obecności

odpowiedniego enzymu wyzwala reakcję świetlną.)

POLIMERAZOWA REAKCJA

AMPLIFIKACJI

(PCR)

•

polega na enzymatycznym powieleniu

in vitro

wybranego, ściśle gatunkowo-swoistego odcinka

DNA

•

wielokrotnioną liczbę otrzymanych fragmentów

DNA wykrywa się w świetle UV na żelach

agarozowych, wybarwionych bromkiem etydyny

•

onda molekularna z użyciem techniki PCR jest

coraz

szerzej

stosowana

diagnostyce

coraz

szerzej

stosowana

diagnostyce

mikrobiologicznej, zwłaszcza zakażeń lub zarażeń

wywoływanych

przez

drobnoustroje

trudno

wywoływanych

przez

drobnoustroje

trudno

hodowlane lub występujące w materiale w bardzo

małych ilościach, wewnątrzkomórkowo, np.:

•

wirusy

HIV 1 i HIV 2, HCV 1 i HCV 2,

enterowirusy,

rotawirusy

•

bakterie

Mycobacterium spp., Borellia

burgdorferi,

Chlamydia

spp.,

burgdorferi,

Chlamydia

spp.,

Mycoplasma spp., H. influenzae, Listeria

monocytogenes

•

grzyby

Cryptococus

neoformans

Cryptococus

neoformans

grzyby dimorficzne

•

pierwotniaki

Giardia

lamblia,

Giardia

lamblia,

Toxoplasma gondii

METODA (DYFUZYJNO -

KRĄŻKOWA)

•

przy użyciu krążków nasyconych antybiotykami o

odpowiednich stężeniach

•

tosowane są 2 metody: wg

ICS

(

International

Collaborative Study

) lub zgodne z

NCCLS

(

National Committetee for Clinical Laboratory

Standards

)

•

arunkiem otrzymania wiarygodnego wyniku jest

pełne wystandaryzowanie warunków w jakich

prowadzone jest badanie

•

żywane podłoża muszą mieć odpowiednie pH i

skład jonowy

•

ażne jest również, aby podłoża rozlewane były

miarowo i miały odpowiednią grubość

•

stotne znaczenie ma także gęstość hodowli

stosowana w badaniu

Metody przygotowania zawiesiny

badanego szczepu (inokulum) do

oznaczania:

•

standardowa

–

używa

się

hodowli

–

używa

się

hodowli

logarytmicznej w fazie wzrostu; polega na

inkubacji przez 2-8 h w temp

35-37

bulionowej zawiesiny 4-5 kropli badanego

szczepu do uzyskania zmętnienia równego 0,5

jednostki w skali McFarlanda

•

bezpośredniego zawieszania

– zawiesiną

badanego szczepu sporządza się w jałowym

bulionie lub ja

owej soli fizjologicznej do gęstości

równej 0,5 jednostki w skali McFarlanda

•

Bez względu na sposób przygotowania inokulum

jego gęstość powinna dla większości bakterii

wynosić

0,5 w skali McFarlanda

lub więcej dla

określonych gatunków bakterii np. Helicobacter

pylori.

•

Tak wykonaną zawiesinę wymazuje się na

powierzchnię

agaru

Mueller-Hinton

powierzchnię

agaru

Mueller-Hinton

wyschnięciu układa się krążki bibułowe nasycone

antybiotykami.

•

o całonocnej inkubacji mierzy się średnice stref

zahamowania wzrostu (w mm) i interpretuje ze

stosowanym standardem (NCCLS lub ICS).

•

Wielkość

strefy

zahamowania

wzrostu

jest

Wielkość

strefy

zahamowania

wzrostu

jest

odwrotnie proporcjonalna do wartości MIC danego

antybiotyku wobec badanego szczepu.

METODY ROZCIEŃCZENIOWE

W PODŁOŻU STAŁYM LUB

PŁYNNYM

•

metody ilościowe

polegają

na sporządzaniu

serii kolejnych rozcieńczeń badanego antybiotyku

•

określają najmniejsze stężenia antybiotyków

hamujące wzrost drobnoustrojów (

MIC

w mg/l)

lub najniższe stężenie bakteriobójcze (

MBC

mg/l)

•

adane szczepy są inkubowane w probówkach

(hodowla płynna) lub na płytkach agarowych

zawierających odpowiednie stężenie antybiotyku

•

inimalnym stężeniem hamującym będzie to, w

którym brak jest wzrostu drobnoustrojów

widocznego gołym okiem

PODZIAŁ SZCZEPÓW

BAKTERYJNYCH

wg lekowrażliwości

•

wrażliw

(S=sensitive), gdy wartość MIC ≤ od

stężenia tego chemioterapeutyku osiąganego w

surowicy przy normalnym dawkowaniu leku

•

średniowrażliwe

(I=intermediate), w leczeniu

mogą być użyte antybiotyki, których stężenie w

surowicy

może

być

podwyższone

przez

surowicy

może

być

podwyższone

przez

zwiększenie jednorazowych dawek leku

•

oporne

(R=resistant), których wartości MIC > od

stężenia tego chemioterapeutyku osiąganego w

surowicy

INNE

METODY

•

E-test

– gotowe p

aski nasycone są antybiotykami w

gradiencie stężenia, od najwyższego do najmniejszego,

a podziałka pozwala na dokładne odczytanie wartości

MIC

•

metody

półautomatyczne

lub

automatyczne

półilościowe

lub

ilościowe

gotowe

panele

gotowe

panele

zawierające graniczne rozcieńczenia antybiotyków

(

break-point

Panele

takie

są

odczytywane

Panele

takie

są

odczytywane

specjalnych urządzeniach ATB i Sceptor.

ogą być

jednak stosowane wyłącznie w laboratoriach z

personelem wyszkolonym w dziedzinie mikrobiologii

klinicznej. Pozwala to na korygowanie pojawiających się

czasem absurdalnych wyników odczytu urządzenia

Document Outline