Przeciwciała poliklonalne
i monoklonalne
1.
Różnice pomiędzy przeciwciałami
poliklonalnymi
i monoklonalnymi
2.
Produkcja przeciwciał poliklonalnych
•
przygotowanie antygenu
•
wybór zwierząt do immunizacji
•
podawanie antygenu zwierzętom immunizowanym
•
kontrola przebiegu reakcji immunologicznej
•
ocena uzyskanych przeciwciał; ich miano i swoistość
3.
Produkcja przeciwciał monoklonalnych
4.
Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych
Przeciwciała poliklonalne
Mieszanina cząsteczek przeciwciał
wytworzonych przez kilka klonów komórek.
Wiążą one różne części antygenu z różnym
powinowactwem.
Przeciwciała monoklonalne
Są wytwarzane przez pojedynczy klon komórek,
tzn. komórki siostrzane.
Wszystkie cząsteczki tych przeciwciał są
identyczne
i wiążą się z tym samym miejscem antygenu
z jednakowym powinowactwem.
TEORIA SELEKCJI KLONALNEJ
Otrzymywanie
surowicy poliklonalnej
Otrzymywanie
przeciwciał monoklonalnych
Pobierani
e
surowicy
Szczepienie myszy
antygenem
zawierającym 3 różne
determinanty
antygenowe
Mieszaninę przeciwciał
skierowanych przeciwko
trzem różnych
determinantom
antygenowym
Pobieranie
limfocytów
B
ze
śledziony
Komórki
szpiczaka
Powstają komórki
hybrydowe zdolne
do syntezy
przeciwciał
Przeciwciała
monoklonaln
e
IMMUNIZACJA
Przygotowanie
antgenu
HAPTENY
-
cząsteczki które nie są immunogenne,
chociaż mają właściwości antygenowe
Do haptenów należą:
hormony peptydowe,
hormony sterydowe,
niektóre leki (np. penicylina, aspiryna,
sulfonoamidy),
sacharydy wchodzące w skład antygenów
somatycznych
pałeczek Gram (-).
HAPTENY MOGĄ STAĆ SIĘ
IMMUNOGENNE PO ZWIĄZANIU Z
BIAŁKIEM - NOŚNIKIEM
HAPTENY
Doświadczenia Karla Landsteinera
Karl
Landsteiner
Nagroda Nobla
w 1930 r.
Po szczepieniu
Zdolność haptenów do indukowania swoistej odpowiedzi humoralnej po
związaniu z nośnikiem wykorzystuje się do otrzymywania przeciwciał
skierowanych np. przeciw
hormonom
. Przeciwciała te stosuje się w testach
diagnostycznych.
Związanie się haptenów z białkami organizmu np. białkami osocza może
prowadzić
do reakcji nadwrażliwości (uczuleń).
Przykłady sprzęgania haptenów
z nośnikiem białkowym
Rodzaj haptenu
Grupy
funkcyjne
Najczęstsze
rodzaje
pochodnych
Metoda
sprzęgania
z nośnikiem
Prostaglandy
ny
–COOH
(–OH, =O)
sprzęganie
bezpośrednie
karbodwuimidy
metoda
Erlangera
Sterydy
–OH
=O
bursztyniany
CMO-pochodne
metoda
Erlangera
karbodwuimidy
Nukleotydy
–OH rybozy
(–NH
2
)
bursztyniany
karbodwuimidy
Tyroniny
–COOH
–NH
2
bezpośrednie
sprzęgania
tyronin lub ich
estrów
metylowych
karbodwuimidy
Oligopeptydy
–COOH
–NH
2
(–OH)
Sprzęganie
bezpośrednie
karbodwuimidy
aldehyd
glutarowy
h
C
O
N
H
CH
2
b
-
H
2
O
h
C
O
NH
CH
2
b
OH
+
H
h
NH
2
+
O
C
H
CH
2
CH
2
CH
2
C
H
O
+
H
2
N
b
h
N
CH CH
2
CH
2
CH
2
CH
N
b
- 2H
2
O
Sprzęganie haptenu z nośnikiem
białkowym
Bezpośrednia reakcja haptenu lub jego pochodnej z nośnikiem
Sprzęganie haptenu z nośnikiem za pomocą związku pośredniego,
który tworzy „mostek„ między haptenem a nośnikiem
Reakcja sprzęgania haptenu lub jego
pochodnej (
h
) z białkiem (
b
)
Metoda „mieszanych bezwodników” (Erlangera)
O
C
O
C
HO
C
O
h
+
O
C
O
O
C
O
h
- HCl
+
H–N–H
b
CO
NH
h
b
+
O
C
O
OH
Hapten
o właściwościach
lipofilnych
Reakcja sprzęgania haptenu lub jego pochodnej (
h
) z
białkiem (
b
)
Kondensacja za pomocą karbodwuimidu (EDC)
C
N
N
N
O
C
H
O
h
+
N
H
H
b
N
C
N
N
O
C
O
h
+
CO
NH
h
b
+
N
H
C
N
H
N
O
Hapten
o właściwościach hydrofilnych
Niektóre stosowane adiuwanty
Adiuwant
Mechanizm działania
Olej parafinowy, arachidowy
(emulsje z wodnym roztworem
antygenu)
Tworzenie depot antygenu w miejscu podania:
opóźnianie uwalniania antygenu z tkanek,
wywoływanie zapalenia
w miejscu podania)
Wodorotlenek i fosforan glinu,
węglan i fosforan wapnia, cząsteczki
lateksu, akrylu, betonitu
Precypitacja rozpuszczalnych antygenów;
wywoływanie odczynu zapalnego, tworzenie depot
antygenu w tkankach
Zabite prątki gruźlicy i ich skłądniki
(MDP, PPD), Corynebacterium,
peptydyloglikan P40, Bordetella
pertussis
Aktywacja makrofagów, zwiększona synteza cytokin
(IL-1,
IL-4, IL-6, IFN, CSF) i skłądników dopełniacza;
poliklonalna aktywacja limfocytów T
Immunogenne białka (np. anatoksyna
tężcowa) połączone z antygenem
Aktywacja limfocytów T pomocniczych
ISCOM, SAF, pęcherzyki lipidowe
(liposomy)
Agregowanie antygenu na powierzchni, transport
antygenu do węzłów limfatycznych, ułatwianie
kontaktu z błoną komórki prezentującej antygen
LPS
Poliklonalna aktywacja limfocytów B
Nietoksyczne pochodne LPS
Aktywacja makrofagów, dopełniacza, indukcja
syntezy cytokin (GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, IL-1)
Mikrokapsułki
Transport antygenu do węzłów limfatycznych,
przedłużone uwalnianie antygenu
Inulina, zymozan
Ułatwianie alternatywnej drogi aktywacji kaskady
dopełniacza, ułątwianie interakcji antygenu z
komórkami posiadającymi receptor dla C3b
(makrofagi, limfocyty B, komórki dndrytyczne
ośrodków rozmnażania)
Cytokiny (interferony, IL-3, IL-12)
Aktywacja makrofagów, limfocytów T, stymulowanie
rozwoju subpopulacji Th)
0
1
2
3
4
5
6
7
Podawanie antygenu
Przeciwciała
monoklonalne
Produkcja przeciwciał monoklonalnych
Izolacja
mysich
limfocytów
Hodowla
komórek
szpiczaka
Fuzja
komórek
Hodowla hybryd
Klonowanie
pojedynczych
komórek hybryd
Brak
pożądanych
przeciwciał –
odrzucenie
komórek
Klonowanie
pojedynczych
komórek hybryd
Obecność
przeciwciał
przeciwko
antygenowi X
Hodowla
sklonowanyc
h komórek
Oczyszczanie
przeciwciał
monoklonalnych
Uczulenie
myszy
antygenem
X
Produkcja przeciwciał monoklonalnych
Postępowanie z hybrydami
Kryteria oceny jakości
przeciwciał
Wysokie miano
Duża swoistość (mała krzyżowa reaktywność z
analogami antygenu)
Maksymalna czułość (wysoka stała
powinowactwa)
Maksymalna stromość krzywej rozcieńczeń
surowicy odpornościowej
Najlepsza liniowość krzywej wzorcowej log-
logitowej (współczynnik regresji w zakresie 0,8-
1,2)
Mała wrażliwość na nieswoiste hamowanie
wiązania antygenu przez czynniki zawarte w
surowicy krwi
lub w wyciągach tkankowych
Reakcje krzyżowe
Przeciwciała mogą reagować nie tylko z antygenem, który in vivo wywołał
ich powstanie, lecz także z innymi antygenami o podobnej strukturze
(identyczny lub podobny fragment epitopu).
Przeciwciała anty-A
reagują krzyżowo z
antygenem B
.
Wykrywanie i określanie stężenia hormonów, enzymów i leków w
testach RIA
i ELISA
Oczyszczanie czynników i hormonów
Diagnostyka i lokalizacja nowotworów (ognisk pierwotnych i
przerzutów)
Leczenie nowotworów
Prognozowanie w chorobie nowotworowej
Immunosupresja (np. przeciwciał przeciw limfocytom T, IL-2 lub jej
receptorowi)
•
U pacjentów z przeszczepem allogenicznym
•
U pacjentów z chorobą autoimmunizacyjną
Wykrywanie antygenów HLA podczas doboru dawców przeszczepów
Wykrywanie antygenów mikroorganizmów w czssie diagnostyki
chorób zakaźnych
Zmniejszenie infekcyjności mikroorganizmów
Neutralizacja toksyn
Regulacja odpowiedzi immunologicznej (np. przeciwciała
antyidiotypowe)
Zastosowanie przeciwciał
monoklonalnych
Pochodne przeciwciał
monoklonalnych
Immunotoksyny
Przeciwciało
o podwójnej swoistości
Przeciwciało chimeryczne
Jednołańcuchowe białko wiążące antygen
(jednołańcuchowy fragment Fv)
Biwalentny fragment Fv
Fragment
Fv o podwójnej swoistości
Fv
CDR3
antygen
epitopy
Przeciwciała antygenizowane
The utilization of radiolabelled specialized proteins delivers radiation therapy directly to
a tumor site. This new form of gene therapy utilizes
"Smart Bomb"
technology and is
available at only a few sites in the US.
Przeciwciało
monoklonalne
przeciwko CD20
Przeciawciało znakowane izotopem
Wytwarzanie PM
„
uczłowieczonych
”
C V
KONIEC
Sprzęganie haptenów z białkiem
za pomocą karbodwuimidów
Hapten
Rozpuszczalnik
Karbodwuimi
d (CDI)
CDI : hapten
(stos.
molarny)
Czteropeptyd
gastryny
N, N-
dwumetyloformamid
morfo-CDC
3 : 1
ACTH
HCl
EDC
20 : 1
Angiotensyna
Woda destylowana
EDC
100 : 1
Trójjodotyroni
na
NaOH
EDC
25 : 1
Półbursztynia
n cAMP
Woda destylowana
EDC
3 : 1
Prostaglandyn
y
10% etanol w Na
2
CO
3
EDC
2 : 1
Półbursztynia
n 11
α
-
hydroksy-
progesteronu
Bezwodny dioksan
DCDI
3 : 1
Genetically engineered anti-TNF molecules
Reakcje homo- i heterologiczne
względem oznaczanej substancji
Typ układu
Nazwa reakcji
Przykłady
Przeciwciała
Hormon
znakowan
y
Hormon wzorcowy
i oznaczany
a-(fragm.)A
/A*/A
Superhomologicz
na
a–βHLH
HLH*
HLH
a–A /A*/A
Pełna
homologiczna
a-HGH
HGH*
HGH
a-B /A*/A
Niepełna
homologiczna
a–(E
2
–6
–
–
CMO– BSA)
a–BLH
E
2
*
PLH*
E
2
(estradiol)
PLH
a–A /B*/A
Niepełna
heterologiczna
a–BPRL
OPRL*
BPRL
(prolaktyna)
a–B /B*/A
Pełna
heterologiczna
a–PINS
PINS*
HINS (insulina)
a
–C /B*/A
Podwójnie
heterologiczna
a
–OPRL
PPRL*
HPRL
(prolaktyna)
H – ludzki (human)
P – wieprzowy (porcine)
N – bydlęcy (bovine)
O – owczy (ovine)
Tumor necrosis therapy utilizes monoclonal antibodies targeting
intracellular tumor antigens on necrotic (dead) tissue. This method
overcomes some of the limitations of current antibody-based
therapeutic approaches, reported Alan Epstein, MD, PhD, USC
Medical Center, department of pathology, LA, CA, at the 11th
International Conference on Monoclonal Antibodies for Cancer
Przeciwciała związane
z liposomami rozpoznają
komórkę nowotworową,
wnikają do niej i uwalniają
lek.
Przeciwciało rozpoznaje
białko
HER2/neu
,
występujące
na komórkach
nowotworowych w dużych
ilościach.
Reakcje krzyżowe wykorzystywane są w diagnostyce,
np. kiły.
Reakcje krzyżowe wykorzystywane są w szczepionkach.
Szczepienie wirusem krowianki (E. Jenner) lub wirusem
vaccinia chroni przed zachorowaniem na ospę, którą
wywołuje wirus variola.
Reakcje krzyżowe
Reakcje krzyżowe uczestniczą w reakcjach
autoimmunologicznych - jeśli zdarzy się, że antygeny
bakteryjne lub wirusowe mają podobne epitopy do
białek organizmu - zjawisko molekularnej mimikry.
•
Przeciwciała przeciwko białku M paciorkowców reagują krzyżowo
z białkami mięśnia sercowego
•
Przeciwciała przeciwko Campylobacter jejuni reagują krzyżowo
ze składnikami mieliny
•
Przeciwciała przeciw bakteryjnym białkom szoku termicznego
występują
u chorych z reaumatoidalnym zapaleniem stawów
Epitopes found on the mouse part of the construct in the
framework region (FR).
Anti-allotypic and anti-idiotypic
responses may also
contribute to drug immunogenicity.
