Metoda PCR
Metoda PCR
Metoda PCR
Metoda PCR
PCR
PCR
Polymerase Chain
Polymerase Chain
Reaction –
Reaction –
Łańcuchowa reakcja
Łańcuchowa reakcja
polimeryzacji
polimeryzacji
Do przeprowadzenia PCR potrzebne są:
Do przeprowadzenia PCR potrzebne są:
• wyizolowana, o odpowiedniej czystości matryca
DNA
• odpowiednie środowisko reakcji- bufor, jony
Mg²+
• startery
• dNTP
• termostabilna polimeraza DNA
• opcjonalnie: substancje stabilizujące
Jak należy dobrać startery do
Jak należy dobrać startery do
reakcji PCR:
reakcji PCR:
•
powinny zawierać około 50% par GC
powinny zawierać około 50% par GC
•
długość primerów powinna wynosić około 20-30 zasad
długość primerów powinna wynosić około 20-30 zasad
•
startery nie powinny zawierać w 3' końcowej części
startery nie powinny zawierać w 3' końcowej części
fragmentów komplementarnych do siebie samych oraz
fragmentów komplementarnych do siebie samych oraz
do drugiego startera
do drugiego startera
•
temperatura ich topnienia powinna występować w
temperatura ich topnienia powinna występować w
przedziale 50-60˚C.
przedziale 50-60˚C.
•
nie mogą tworzyć struktur typu spinki do włosów
nie mogą tworzyć struktur typu spinki do włosów
•
muszą być komplementarne do fragmentów matrycy
muszą być komplementarne do fragmentów matrycy
•
stężenie starterów w mieszaninie powinno być optymalne
stężenie starterów w mieszaninie powinno być optymalne
•
startery powinny być wydłużane w kierunku jeden do
startery powinny być wydłużane w kierunku jeden do
drugiego
drugiego
Temperatura topnienia
• Temperatura topnienia jest to temperatura dysocjacji
dupleksu
primer - matryca.
• Wartość temperatury topnienia rośnie wraz ze
wzrostem zawartości cytozyny i guaniny w łańcuchu.
Jest to spowodowane tym,
iż pomiędzy tymi zasadami występuje po trzy wiązania
wodorowe, natomiast pomiędzy adenina i tymina tylko
dwa.
•
Najprostszym modelem do obliczania
temperatury topnienia jest formuła:
Reakcja PCR składa się z wielokrotnie
Reakcja PCR składa się z wielokrotnie
powtarzanego cyklu
powtarzanego cyklu
trzech etapów, które
trzech etapów, które
zachodzą w rożnych temperaturach.
zachodzą w rożnych temperaturach.
Trzy etapy PCR :
Trzy etapy PCR :
1) Denaturacja
1) Denaturacja
2) Hybrydyzacja odcinków starterowych
2) Hybrydyzacja odcinków starterowych
3) Elongacja
3) Elongacja
Przebieg
Przebieg
reakcji
reakcji
:
:
Gdyby wydajność reakcji PCR była
Gdyby wydajność reakcji PCR była
stuprocentowa, po n cyklach reakcji z
stuprocentowa, po n cyklach reakcji z
jednej cząsteczki można by uzyskać 2
jednej cząsteczki można by uzyskać 2
do n-tej potęgi cząsteczek DNA.
do n-tej potęgi cząsteczek DNA.
Polimeraza Taq
•enzym z grupy polimeraz DNA wyizolowany z bakterii
Thermus aquaticus
•stabilny termicznie
•nie wykazuje aktywności 3'->5' egzonukleazy
•Do swej aktywności wymaga jonów Mg
Tremocykler
Jest urządzeniem służącym do sterowania temperaturą.
Zakres zmiany temperatury zależy m.in. od długości
odcinka DNA, który planujemy powielić, od długości
starterów oraz optimów temperaturowych enzymów
(polimeraz).
Sterowanie temperaturą możliwe jest dzięki
wprowadzeniu do pamięci termocyklera określonego
programu,na podstawie której powielamy badany DNA.
Okresowe zmiany temperatury wywołują różnego typu
reakcje chemiczne, które zachodząc cyklicznie
Zalety metody PCR:
Zalety metody PCR:
•
Bardzo czuła.
Bardzo czuła.
•
Prosta w wykonaniu
Prosta w wykonaniu
•
Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu
Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu
•
możemy powielać materiał genetyczny pobrany
możemy powielać materiał genetyczny pobrany
zarówno z żywych, jak i martwych tkanek
zarówno z żywych, jak i martwych tkanek
•
metoda specyficzna
metoda specyficzna
Wady metody PCR:
Wady metody PCR:
•
należy utrzymywać sterylne warunki : sterylność
należy utrzymywać sterylne warunki : sterylność
wszystkich używanych urządzeń w reakcji
wszystkich używanych urządzeń w reakcji
•
po reakcji PCR nie ma dowodów, że ta reakcja
po reakcji PCR nie ma dowodów, że ta reakcja
nastąpiła,
nastąpiła,
aby to stwierdzić stosujemy elektroforezę.
aby to stwierdzić stosujemy elektroforezę.
Zastosowanie PCR:
Zastosowanie PCR:
•
wykrywanie bardzo małych ilości bakterii w
wykrywanie bardzo małych ilości bakterii w
tkankach
tkankach
•
diagnostyka chorób dziedzicznych
diagnostyka chorób dziedzicznych
•
ustalanie ojcostwa
ustalanie ojcostwa
•
przy ustalaniu pochodzenia śladów krwi
przy ustalaniu pochodzenia śladów krwi
• uzyskiwanie dużych ilości DNA np. do klonowania
• znakowanie fragmentów DNA
• cykliczne sekwencjonowanie
• identyfikacja organizmów – genotypowanie
Multipleks PCR
Multipleks PCR
Metoda ta polega na amplifikacji kilku regionów DNA w
czasie jednej reakcji PCR. Reakcja ta wymaga użycia
kilku par starterów
o podobnej temperaturze topnienia tak by można było
użyć jeden profil temperaturowy reakcji.
Schemat obrazujący zasadę działania
Schemat obrazujący zasadę działania
multipleks PCR
multipleks PCR
ZALETY MULTIPLEKS PCR :
ZALETY MULTIPLEKS PCR :
•
system wewnętrznej kontroli
system wewnętrznej kontroli
•
kontrola jakości matrycy
kontrola jakości matrycy
•
ocena ilości docelowej sekwencji w
ocena ilości docelowej sekwencji w
badanej próbie
badanej próbie
•
wysoka wydajność
wysoka wydajność
Z
ZASTOSOWANIE MULTIPEKS PCR :
ZASTOSOWANIE MULTIPEKS PCR :
wykrywanie delecji i innych zmian w sekwencji docelowej
wykrywanie delecji i innych zmian w sekwencji docelowej
polymorphic Repetitive DNA (polimorficzne
polymorphic Repetitive DNA (polimorficzne
powtarzalne sekwencje DNA)
powtarzalne sekwencje DNA)
wykrywanie i charakteryzacja mikroorganizmów
wykrywanie i charakteryzacja mikroorganizmów
grzybów, bakterii , wirusów oraz pasożytów.
grzybów, bakterii , wirusów oraz pasożytów.
Modyfikacje reakcji PCR
Modyfikacje reakcji PCR
PCR-RFLP
PCR-RFLP
RAPD-PCR
RAPD-PCR
PCR-CCM
PCR-CCM
PCR-PTT
PCR-PTT
RT-PCR
RT-PCR
ACRS-PCR
ACRS-PCR
ARMS-PCR
ARMS-PCR
ASA-PCR
ASA-PCR
PCR-ASO
PCR-ASO
PCR-HD
PCR-HD
PCR-SSCP
PCR-SSCP
PCR-DGGE
PCR-DGGE
PCR-TGGE
PCR-TGGE
inversed PCR
inversed PCR
PCR-OLA
PCR-OLA
REP-PCR
REP-PCR
Real-Time PCR
Real-Time PCR
ODWROTNA
ODWROTNA
TRANSKRYPCJA
TRANSKRYPCJA
Schemat od DNA do Białka
Odwrotna transkrypcja
Odwrotna transkrypcja
W reakcji odwrotnej transkrypcji wykorzystuje się
właściwości niektórych polimeraz DNA zależnych od
RNA do syntezy nici cDNA na RNA jako matrycy.
Odwrotna transkrypcja odbywa się w kierunku 3'→5'.
Schemat odwrotnej transkrypcji
Schemat odwrotnej transkrypcji
RT-PCR
RT-PCR
transcription polymerase chain reaction
Jedna z modyfikacji metody PCR, w którym pierwszy
etap jest przeprowadzony przez odwrotną
transkryptazę, a jako matryca służy cząsteczka mRNA.
Podstawowe cechy i zalety RT PCR:
- umożliwia utworzenie cDNA na matrycy
RNA
- cDNA jest znacznie stabilniejszy niż RNA
- cDNA może być amplifikowany za pomocą
PCR
Zastosowania RT-PCR
Zastosowania RT-PCR
• Wykrywanie nawet minimalnej obecności RNA w
próbie.
• Diagnozowanie chorób genetycznych.
• Wprowadzanie informacji genetycznej komórki
eukariotycznej do komórki prokariotycznej.
(Inżynieria genetyczna)
• Wykrywanie nowotworów. (wykrywanie cząsteczek
mRNA –biomarkerów typowych dla danego typu
komórki nowotworowej.)
Dwa warianty RT-PCR
Dwa warianty RT-PCR
• Wariant I – reakcja w jednym kroku.
• Wariant II- reakcja w dwóch krokach.
Korzyści prowadzenia reakcji
Korzyści prowadzenia reakcji
w Wariancie I i II
w Wariancie I i II
• Wariant I :
1) Reakcja mniej czasochłonna.
2) Małe ryzyko zanieczyszczenia środowiska rekacji
wszechobecnymi enzymami bądź kwasami nukleinowymi.
• Wariant II :
1) Możliwość zastosowania optymalizacji reakcji np. Poprzez
dobór warunków reakcji.
2) Szerokie pole możliwych zastosowań zależne od użytego
specyficznego primera ( startera).
3) Możliwość otrzymywania bardzo długich
komplementarnych łańcuchów DNA (cDNA)