Podsumowanie ćwiczenia 6 –
fotoreaktywacja
Prób
a
AB1157
BH200 (30sek
UV)
BH200 (1 min UV)
E-arg
MF
(x10
-8
)
LB
(x10
8
)
E-arg
MF
(x10
-8
)
LB
(x10
8
)
E-arg
MF
(x10
-8
)
LB
(x10
8
)
K
17
0,39
43,5
4
0,09
44
4,5
0,25
18
A
103
321
0,32
16
3,76
4,25 18
100
0,18
B
166
404
0,41
40
1,6
25
12
3,74
(195)
( 60)
3,21
C
107
13,5
7,9
44
9,7
4,55 22
8,46
2,6
Błędy replikacyjne jako źródło
mutacji
Wstawienie
nieprawidłowej zasady
Poślizg
polimerazy
Choroby traktów poliglutaminowych
(CAG/CTG)
Choroba Huntingtona (odkryta w 1993 r)
Choroba Huntingtona (odkryta w 1993 r)
Gen HD - w egzonie 1 występuje 7-34 powtórzeń
CAG
Mutacja
> 40 powtórzeń
Objawy: gromadzenie w jądrach komórek źle
sfałdowanego białka lub odciętego przez kaspazy
traktu poliGlu -
interakcja i hamowane czynników
transkrypcyjnych oraz deacetylazy histonów
Ćwiczenie 7
niestabilność trójek
nukleotydowych
Ekspansja trójek nukleotydowych (CAG)
– choroba Huntingtona
Ekspansja zależna od
MSH2
Delecja niezależna od
MSH2
3'
5'
5'
3'
G
A
C
C
A
G
CAGCAGCAGCAG
5'
3'
G
A
C
C
A
G
5'
3'
G
A
C
C
A
G
MSH2
MSH2
MutS β
(Msh2−Msh3)
powoduje ekspansję
CAG w sekwencji kodującej u myszy HD
Naprawia pętle
insercyjno-
delecyjne
Naprawia błędnie
sparowane zasady
Ekspansja jest zależna od obecności 8-OHG w
DNA
7 tyg myszy – brak ekspansji
52 tyg myszy – ekspansja
Wzrost uszkodzeń DNA z wiekiem:
3MeA – 1,2 raza; 5OHC – 8 razy; 8-OHG – 3
razy
Mutacja białka OGG1 (wycina z DNA 8-OHG i
nacina nić DNA) hamuje ekspansję
Inne glikozylazy nie są zaangażowane
1. Izolacja plazmidów zawierających
wstawki CGT/CAT różnej długości ze
szczepów bakterii MMR
-
oraz MMR
+
(kit)
2. Elektroforeza agarozowa
3. Izolacja własnego DNA z nabłonka
policzka – kit (przygotowanie do ćwiczenia
9)
4. Liczenie wyników ćwiczenia 6 – liczymy
mutanty i wszystkie łysinki.
Dziś wykonujemy:
Transformacja DNA faga
M13 do szczepów E.
coli:
1.
JM 105 uvr – obecne 3 polimerazy
SOS
2.
JM 105 uvr dinB umuDC – tylko
Pol II
3.
JM 105 uvr polB umuDC – tylko Pol
IV
4.
JM 105 uvrA dinB polB - tylko Pol
V
Polimerazy DNA o obniżonej wierności -
podsumowanie
Przeżyc
ie
Stęż.
HNE
Pol
II, IV,
V
Pol II Pol IV Pol V
0
100
100
100
100
5
102
85
43
27
67
15
87
114
66
8,7
80
50
36
93
18
3,4
24