Nowe narzędzia w
Nowe narzędzia w
diagnostyce
diagnostyce
laboratoryjnej
laboratoryjnej
Jerzy Naskalski
Jerzy Naskalski
Zakład Diagnostyki Collegium Medicym UJ
Zakład Diagnostyki Collegium Medicym UJ
Nowe narzędzia w
Nowe narzędzia w
diagnostyce
diagnostyce
laboratoryjnej
laboratoryjnej
Jerzy Naskalski
Jerzy Naskalski
Zakład Diagnostyki Collegium Medicym UJ
Zakład Diagnostyki Collegium Medicym UJ
Diagnostyka to pojęcie wywodzące
Diagnostyka to pojęcie wywodzące
się od greckiego słowa „
się od greckiego słowa „
gnosis
gnosis
”
”
czyli wiedza
czyli wiedza
Diagnoza oznacza
Diagnoza oznacza
pozyskiwanie wiedzy o
pozyskiwanie wiedzy o
chorym i jego
chorym i jego
dolegliwościach
dolegliwościach
Koncepcja narządowa:
Koncepcja narządowa:
„
„
Choroba jest to
Choroba jest to
strukturalnie zdefiniowane
strukturalnie zdefiniowane
uszkodzenie tkanek lub
uszkodzenie tkanek lub
narządów”
narządów”
Podstawy diagnostyki
Podstawy diagnostyki
narządowej
narządowej
Badania laboratoryjne jest łatwo dostępnym
Badania laboratoryjne jest łatwo dostępnym
źródłem informacji na temat procesów
źródłem informacji na temat procesów
zachodzących w komórkach różnych
zachodzących w komórkach różnych
narządów
narządów
Narządowe profile badań
Narządowe profile badań
laboratoryjnych oceniających
laboratoryjnych oceniających
aktywności enzymów, obecność
aktywności enzymów, obecność
białek i tworzenie produktów
białek i tworzenie produktów
mogą być podstawą diagnozy
mogą być podstawą diagnozy
Koncepcja pośredniej biopsji
Koncepcja pośredniej biopsji
biochemicznej
biochemicznej
(Carmen, Wróblewski, Ledue
(Carmen, Wróblewski, Ledue
1959)
1959)
Każde uszkodzenie narządu
Każde uszkodzenie narządu
manifestuje się poprzez
manifestuje się poprzez
charakterystyczny obraz zmiany
charakterystyczny obraz zmiany
składników płynów ustrojowych
składników płynów ustrojowych
i/lub wydzielin, do których
i/lub wydzielin, do których
przedostają się produkty
przedostają się produkty
uszkodzenia komórek
uszkodzenia komórek
Markery uszkodzeń
Markery uszkodzeń
narządowych
narządowych
Uszkodzenie narządu zwykle prowadzi
Uszkodzenie narządu zwykle prowadzi
do wydzielenia do płynów
do wydzielenia do płynów
śródtkankowych i do krwi substancji
śródtkankowych i do krwi substancji
normalnie we krwi nieobecnych
normalnie we krwi nieobecnych
Jeżeli uszkodzenie narządu upośledza
Jeżeli uszkodzenie narządu upośledza
jego funkcję, następuje zaburzenie
jego funkcję, następuje zaburzenie
fragmentu homeostazy
fragmentu homeostazy
biochemicznej, kontrolowanej przez
biochemicznej, kontrolowanej przez
narząd
narząd
Założenia koncepcji
Założenia koncepcji
diagnostyki opartej o
diagnostyki opartej o
oznaczanie markerów
oznaczanie markerów
procesów chorobowych (1)
procesów chorobowych (1)
Każdy narząd wytwarza
Każdy narząd wytwarza
charakterystyczny dla
charakterystyczny dla
siebie profil białek
siebie profil białek
(markerów),
(markerów),
których ilość i
których ilość i
własności zależą od stanu
własności zależą od stanu
funkcjonalnego narządu
funkcjonalnego narządu
Założenia koncepcji
Założenia koncepcji
diagnostyki opartej o
diagnostyki opartej o
oznaczanie markerów
oznaczanie markerów
procesów chorobowych
procesów chorobowych
Stwierdzenie obecności
Stwierdzenie obecności
markera może być
markera może być
podstawą diagnozy
podstawą diagnozy
Wykrywanie zmiany krytycznej
Wykrywanie zmiany krytycznej
markera (glikemii) przy
markera (glikemii) przy
monitorowaniu wrównania
monitorowaniu wrównania
cukrzycy
cukrzycy
Stare metody
Stare metody
poszukiwania markerów
poszukiwania markerów
narządowych
narządowych
Enzymy pochodzenia narządowego
Enzymy pochodzenia narządowego
(np.. wątrobowe , sercowe,
(np.. wątrobowe , sercowe,
trzustkowe, kostne)
trzustkowe, kostne)
Zmiany białkowe obserwowane we
Zmiany białkowe obserwowane we
krwi i innych płynach (elektroforeza
krwi i innych płynach (elektroforeza
na żelach, immunoelektroforeza)
na żelach, immunoelektroforeza)
Zmiany własności biologicznych krwi
Zmiany własności biologicznych krwi
(lub płynów) np.. Szybkość opadania
(lub płynów) np.. Szybkość opadania
krwinek, aglutynacja, hemoliza)
krwinek, aglutynacja, hemoliza)
Schemat wykrywania
Schemat wykrywania
niewydolnośći skurczowej serca
niewydolnośći skurczowej serca
oparty o badanie białkowego
oparty o badanie białkowego
markera:
markera:
BNP
BNP
Peptyd
Peptyd
natriuret
natriuret
y
y
c
c
zny typu
zny typu
A
A
(
(
A
A
NP)
NP)
w stężeniu > 7
w stężeniu > 7
μ
μ
g/L
g/L
umożliwia
umożliwia
wykrycie
wykrycie
dysfun
dysfun
k
k
c
c
ji skurczowej
ji skurczowej
le
le
wego
wego
przedsionka serca
przedsionka serca
Obecność peptydu
Obecność peptydu
natriuret
natriuret
y
y
c
c
znego
znego
typu
typu
B
B
(
(
B
B
NP)
NP)
wskazuje na skutki
wskazuje na skutki
dysfun
dysfun
k
k
c
c
ji skurczowej
ji skurczowej
le
le
wego
wego
przedsionka i lewej komory serca, w
przedsionka i lewej komory serca, w
postaci przebudowy (remodelingu)
postaci przebudowy (remodelingu)
struktury mięśnia
struktury mięśnia
Smith et al. BMJ 2000; 320: 906
Smith et al. BMJ 2000; 320: 906
.
.
Schemat wykrywania raka
Schemat wykrywania raka
stercza
stercza
oparty o badanie
oparty o badanie
markerów białkowych
markerów białkowych
PSA i
PSA i
fPSA
fPSA
Nowe metody
Nowe metody
poszukiwania markerów
poszukiwania markerów
narządowych
narządowych
Badanie obecności nowych białek
Badanie obecności nowych białek
narządowych metodami ultraczułej
narządowych metodami ultraczułej
detekcji
detekcji
Badanie zmian strukturalnych białek
Badanie zmian strukturalnych białek
pochodzenia narządowego, również
pochodzenia narządowego, również
fragmentów nie-peptydowych)
fragmentów nie-peptydowych)
Ocena własności biologicznych
Ocena własności biologicznych
zidentyfikowanych białek (czynniki
zidentyfikowanych białek (czynniki
wzrostu, inhibitory, nekrohormony,
wzrostu, inhibitory, nekrohormony,
cytokiny)
cytokiny)
Elektroforeza
Elektroforeza
kapilarna
kapilarna
Metoda ta łączy cechy elektroforezy
Metoda ta łączy cechy elektroforezy
wolnej i elektroforezy przebiegającej na
wolnej i elektroforezy przebiegającej na
polarnym podłożu. Za pomocą
polarnym podłożu. Za pomocą
elektroforezy kapilarnej można rozdzielać i
elektroforezy kapilarnej można rozdzielać i
ilościowo oznaczać zarówno niewielkie
ilościowo oznaczać zarówno niewielkie
peptydy jak również wiele białek o dużych
peptydy jak również wiele białek o dużych
masach cząsteczkowych. Metoda łączy w
masach cząsteczkowych. Metoda łączy w
sobie dwa dotychczas rozdzielne etapy
sobie dwa dotychczas rozdzielne etapy
badania: badanie jakościowe zmian składu
badania: badanie jakościowe zmian składu
białkowego i ocenę ilościową
białkowego i ocenę ilościową
poszczególnych białek w tej samej próbce.
poszczególnych białek w tej samej próbce.
Elektroforeza
Elektroforeza
kapilarna (Zasada
kapilarna (Zasada
metody )
metody )
Rozdział białek w roztworze buforowym odbywa się
Rozdział białek w roztworze buforowym odbywa się
w cienkich i długich (około 300 mm) kapilarach
w cienkich i długich (około 300 mm) kapilarach
kwarcowych. Proces wędrowania białek w polu
kwarcowych. Proces wędrowania białek w polu
elektrycznym modyfikowany jest poprzez ruch
elektrycznym modyfikowany jest poprzez ruch
elektroosmotyczny fazy płynnej i oddziaływanie
elektroosmotyczny fazy płynnej i oddziaływanie
ujemnie naładowanych kwarcowych ścian kapilary.
ujemnie naładowanych kwarcowych ścian kapilary.
Substancje rozpuszczone przemieszczają się
Substancje rozpuszczone przemieszczają się
stosownie do ich ładunku oraz kształtu cząsteczki i
stosownie do ich ładunku oraz kształtu cząsteczki i
stopnia hydrofobowości od „początku do końca”
stopnia hydrofobowości od „początku do końca”
kapilary, gdzie jest źródło światła UV i detektor
kapilary, gdzie jest źródło światła UV i detektor
wykrywający obecność poszczególnych białek w
wykrywający obecność poszczególnych białek w
buforze wypływającym z kapilary.
buforze wypływającym z kapilary.
Porównanie rozdział białek moczu
Porównanie rozdział białek moczu
patologicznego za pomocą
patologicznego za pomocą
elektroforezy na żelu agarozowym i
elektroforezy na żelu agarozowym i
elektroforezy kapilarnej (
elektroforezy kapilarnej (
białkomocz
białkomocz
selektywny
selektywny
)
)
Porównanie rozdział białek moczu
Porównanie rozdział białek moczu
patologicznego za pomocą
patologicznego za pomocą
elektroforezy na żelu agarozowym i
elektroforezy na żelu agarozowym i
elektroforezy kapilarnej (
elektroforezy kapilarnej (
białkomocz
białkomocz
nie
nie
selektywny
selektywny
)
)
Porównanie oceny stężenia białek
Porównanie oceny stężenia białek
surowicy za pomocą rozdziału
surowicy za pomocą rozdziału
metodą elektroforezy kapilarnej i
metodą elektroforezy kapilarnej i
metodami tradycyjnymi
metodami tradycyjnymi
Pojęcie proteomu w
Pojęcie proteomu w
biologii i medycynie
biologii i medycynie
(2)
(2)
Białka związane z danym narządem lub
Białka związane z danym narządem lub
tkanką nazywamy proteomem.
tkanką nazywamy proteomem.
Termin „proteom” przyjęty jako
Termin „proteom” przyjęty jako
„białkowy odpowiednik genomu” (
„białkowy odpowiednik genomu” (
ang:
ang:
protein complement of the genome
protein complement of the genome
),
),
obecnie określa wszystkie białka danej
obecnie określa wszystkie białka danej
tkanki, komórek, organelli komórkowych
tkanki, komórek, organelli komórkowych
lub płynów pozakomórkowych (a w tym
lub płynów pozakomórkowych (a w tym
osocza, płynu śródtkanowego i moczu)
osocza, płynu śródtkanowego i moczu)
Schemat nowego podejścia do
Schemat nowego podejścia do
poszukiwania markerów
poszukiwania markerów
choroby
choroby
Uwarunkownie genetyczne
Uwarunkownie genetyczne
Odziaływania zewnętrzne
Odziaływania zewnętrzne
Zmiany struktury białek
Zmiany struktury białek
Uszkodzenie narządu
Uszkodzenie narządu
Etapy występowania
Etapy występowania
poszczególnych rodzajów
poszczególnych rodzajów
markerów
markerów
Genomika (
Genomika (
mutacje
mutacje
)
)
Odziaływania zewnętrzne
Odziaływania zewnętrzne
(
(
aktywacja genów tworzenie mRNA
aktywacja genów tworzenie mRNA
)
)
Proteomika
Proteomika
(
(
synteza zmodyfikowanych białek
synteza zmodyfikowanych białek
)
)
Metabolomika
Metabolomika
(
(
tworzenie charaterystycznych produktów
tworzenie charaterystycznych produktów
)
)
Pojęcie proteomu w
Pojęcie proteomu w
biologii i medycynie
biologii i medycynie
Organizm ludzki zawiera ok.. 40 tys.
Organizm ludzki zawiera ok.. 40 tys.
Genów natomiast wytwarza ok. 400 tys -
Genów natomiast wytwarza ok. 400 tys -
500 tysięcy odmiennych strukturalnie
500 tysięcy odmiennych strukturalnie
białek.
białek.
Zatem, znajomość ekspresji genów nie
Zatem, znajomość ekspresji genów nie
dostarcza wystarczających informacji o
dostarcza wystarczających informacji o
stanie komórek i tkanek, i dla pełnego
stanie komórek i tkanek, i dla pełnego
zrozumienia procesów fizjologicznych i
zrozumienia procesów fizjologicznych i
patologicznych związanych ze strukturą i
patologicznych związanych ze strukturą i
funkcją białek.
funkcją białek.
Zasady funkcjonowania
Zasady funkcjonowania
proteomiki
proteomiki
Powstawanie funkcjonalnych białek w
Powstawanie funkcjonalnych białek w
organizmie, poza samą syntezą łańcuchów
organizmie, poza samą syntezą łańcuchów
polipeptydowych obejmuje inne jeszcze
polipeptydowych obejmuje inne jeszcze
procesy, takie jak
procesy, takie jak
łączenie łańcuchów
łączenie łańcuchów
polipeptydowych
polipeptydowych
, ich
, ich
modyfikację
modyfikację
chemiczne
chemiczne
polegające na przyłączaniu
polegające na przyłączaniu
reszt
reszt
polisacharydowych
polisacharydowych
,
,
siarczanowych
siarczanowych
,
,
izoprenylowych i innych.
izoprenylowych i innych.
Procesy te mogą ulegać nasileniu,
Procesy te mogą ulegać nasileniu,
hamowaniu lub dewiacji w przebiegu
hamowaniu lub dewiacji w przebiegu
choroby
choroby
Zasady funkcjonowania
Zasady funkcjonowania
proteomiki
proteomiki
Proteomika zajmuje się
Proteomika zajmuje się
wykrywaniem form białek
wykrywaniem form białek
charakterystycznych dla różnych
charakterystycznych dla różnych
stanów funkcjonalnych komórek
stanów funkcjonalnych komórek
Wymaga to poszukiwania i
Wymaga to poszukiwania i
badania specyficznych produktów
badania specyficznych produktów
komórkowych wśród bardzo dużej
komórkowych wśród bardzo dużej
ilości innych (matrycowych) białek
ilości innych (matrycowych) białek
Metody analityczne w
Metody analityczne w
proteomice
proteomice
Elektroforeza dwuwymiarowa na żelu
Elektroforeza dwuwymiarowa na żelu
poliakrylamidowym (2D PAGE)
poliakrylamidowym (2D PAGE)
Spektrometria masowa z jonizacją (ESI)
Spektrometria masowa z jonizacją (ESI)
Spektrometria masowa z
Spektrometria masowa z
jonizacja/desorpcją laserową
jonizacja/desorpcją laserową
wspomaganą matrycą (MALDI)
wspomaganą matrycą (MALDI)
Spektrometria masowa z wspomaganą
Spektrometria masowa z wspomaganą
powierzchniową jonizacją laserem (SELDI)
powierzchniową jonizacją laserem (SELDI)
Scrining proteomiczny
Scrining proteomiczny
Posługujące się metodami o
Posługujące się metodami o
wysokiej rodzielczości
wysokiej rodzielczości
analizujemy równocześnie
analizujemy równocześnie
ilościowo i jakościowo wszystkie
ilościowo i jakościowo wszystkie
białka uwidocznione na rozdziale
białka uwidocznione na rozdziale
Bioinformatyka
Bioinformatyka
Jest osobną dziedziną nauki, która zajmuje się
Jest osobną dziedziną nauki, która zajmuje się
zarządzaniem ogromną ilością danych
zarządzaniem ogromną ilością danych
uzyskiwanych metodami proteomiki.
uzyskiwanych metodami proteomiki.
Archiwizacja - tworzenie baz danych
Archiwizacja - tworzenie baz danych
Analiza danych. sekwencji aminokwasowych
Analiza danych. sekwencji aminokwasowych
przetłumaczonych” z kwasów nukleinowych
przetłumaczonych” z kwasów nukleinowych
lub otrzymanych doświadczalnie
lub otrzymanych doświadczalnie
Zarządzanie dostępem przez Internet do
Zarządzanie dostępem przez Internet do
bezpłatnych i komercyjnych archiwów
bezpłatnych i komercyjnych archiwów
informacji o budowie i strukturach pierwszo,
informacji o budowie i strukturach pierwszo,
drugo i trzecio-rzędowych białek i o ich
drugo i trzecio-rzędowych białek i o ich
funkcji i interakcjach z innymi związkami w
funkcji i interakcjach z innymi związkami w
komórce
komórce
Bazy sekwencji
Bazy sekwencji
peptydowych/białkowy
peptydowych/białkowy
ch
ch
Swiss-Prot:
TrEMBL: www.ebi.ac.uk/trembl
TrEMBL: www.ebi.ac.uk/trembl
UniProt:
:
IPI: www.ebi.ac.uk/IPI
IPI: www.ebi.ac.uk/IPI
Bazy struktur i funkcji białek
Bazy struktur i funkcji białek
(Protein Data Bank)
(Protein Data Bank)
Porównywanie sekwencji peptydów /
Porównywanie sekwencji peptydów /
białkek
białkek
(algorythm BLAST)
(algorythm BLAST)
;www.ebi.ac.uk/blast
Koniec
Koniec