DNA

• Składa się z 4 rodzajów zasad przyłączonych do

rdzenia cukrowo fosforanowego

• Jest polimerem zbudowanym z jednostek

monomerycznych - deoksyrybonukleotydów

• nukleotyd składa się z zasady azotowej, cukru

oraz z jednej lub więcej grup fosforanowych

• Cukrem jest deoksyryboza

• Zasadami azotowymi – pochodne puryny i

pirymidyny

• Łańcuch DNA składa się z

deoksyrybonukleotydów

(dAMP, dGMP, dTMP, dCMP).

Połączone są one resztami

fosforanowymi. Grupa 3'-

hydroksylowa reszty

cukrowej jednego nukleotydu

połączona jest z grupą 5'-

hydroksylową następnej

reszty cukrowej wiązaniem

fosfodiestrowym.

• Sekwencja nukleotydów w

łańcuchu kwasu

nukleinowego opisywana jest

zazwyczaj za pomocą

skrótów jednoliterowych np.:

A-T-G-C-T-A-C-A-G

Model Watsona i Cricka:

• W skład cząsteczki DNA wchodzą

dwa łańcuchy, które biegną
antyrównolegle (tzn. koniec
jednego jest dokładnie naprzeciw
początku drugiego). Łańcuchy
owijają się wokół wspólnej osi i
tworzą tzw. prawoskrętną
podwójną helisę.

• Jeden z łańcuchów-kolor

zielony, drugi-

pomarańczowy; zasady

purynowe i pirymidynowe

mniej intensywne barwy

niż rdzeń cukrowo-

fosforanowy.

Rodzaj DNA/Funkcja

B-DNA

A-DNA

Z-DNA

liczba par zasad

przypadająca na skręt

helisy

10,4 (ok. 10,2 dla

tzw. wysp CpG)

kąt skręcania między

sąsiednimi

parami zasad (w

stopniach)

+ 34,6

+ 32,7

- 30,0

skok helisy (w nm)

3,54

2,53

4,56

kierunek skręcania

prawoskrętna

prawoskrętn

lewoskrętn

średnica helisy (w nm)

2,37

2,55

1,84

Rodzaje DNA i ich charakterystyka

Model Watsona i Cricka:

• Zasady azotowe znajdują się wewnątrz, a fosforany i

reszty deoksyrybozy-na zewnątrz helisy; płaszczyzny
zasad są prostopadłe do osi helisy, a płaszczyzny
pierścieni cukrów są ułożone prostopadle względem
zasad;

• Średnica helisy wynosi 2,0 nm. Odległość między

zasadami wynosi 0,34nm. Zasady są skręcone względem
siebie pod kątem 36 stopni;

• Dwa łańcuchy łączą się ze sobą wiązaniami wodorowymi

między zasadami tworzącymi komplementarne pary;

• Kolejność zasad nie jest w żaden sposób ograniczona.

Ściśle określona sekwencja zasad niesie informację
genetyczną.

Nukleosom

• Kompleks - składający się z DNA jądrowego owiniętego wokół 4 par niewielkich
zasadowych białek-histonów (piąty rodzaj histonu wiąże wolne odcinki DNA pomiędzy
nukleosomami)
• podstawowa jednostka strukturalna fibryli chromatynowej

Fibryle chromatyny zwinięte są w spiralą strukturę zwaną solenoidem.

Chromatyna – między podziałowa postać materiału gen. u organizmów eukariotycznych
w jądrze kom.

• Replikacja zapewnia wierne przekazywanie

informacji zawartej w DNA, zarówno z

komórki macierzystej do komórek

potomnych w mitozie, jak i z jednego

pokolenia na kolejne w procesie mejozy;

• Błędy zachodzące podczas replikacji

umożliwiają zachodzenie procesu ewolucji

• Częstotliwość błędów: jeden na około 10

000 000 zasad do jednego na 1 000 000

000 zasad.

Replikacja DNA

enzymy uczestniczące w procesie

topoizomerazy

– rozplatają podwójną helisę DNA, udostępniając w

ten sposób matrycę dla enzymów replikacyjnych lub
transkrypcyjnych. topoizomeraza I - hydroliza jednego wiązania -
nacięcie jednej nici,
topoizomerazy II - hydroliza dwóch wiązań - nacięcie obu nici

helikazy

- rozrywają wiązania wodorowe między nićmi

matrycowego DNA, rozkręcając helisę i umożliwiając rozpoczęcie
procesu;
prymaza – polimeraza RNA zależna od DNA, syntetyzuje startery
rybonukleotydowe;

polimeraza

DNA

- polimeryzuje zgodnie z zasadą

komplementarności fosforany deoksyrybonukleotydów;
egzonukleaza - usuwa startery RNA z nici;
ligaza DNA – łączy fragmenty Okazaki;

białko SSB

(ang. single strand binding protein) stabilizuje

jednoniciowe (rozplecione) odcinki DNA

białko "ruchomej obręczy"

wiąże polimerazę DNA z nicią DNA.

Na nici opóźnionej, każdorazowo po zakończeniu syntezy fragmentu
Okazaki uwalnia polimerazę DNA.

• najważniejszy enzym replikacji DNA.
• Ma aktywność syntetazy w kierunku 5' -- >3' nowej nici tzn.

dobudowuje nukleotydy DNA w tym kierunku.

• Jednocześnie posiada aktywność nukleazy w kierunku 3' --

>5', dzięki czemu może cofać się i wycinać źle wstawiony
przez siebie nukleotyd i zastąpić go prawidłowym. Dzięki tej
aktywności polimeraza DNA koryguje swoje błędy co
nazywa się redagowaniem.

• Dobudowuje brakujące fragmenty DNA, na nici opóźnionej,

po wycięciu starterów RNA

Polimeraza DNA

Replikacja DNA

• Zaczyna się zawsze w konkretnych miejscach, zwanych

miejscami inicjacji replikacji (ang. origin)

• Od tego miejsca replikacja zazwyczaj przebiega

równocześnie w dwóch kierunkach-widełki replikacyjne
przesuwają się w prawo i lewo, aż połączą się wszystkie
oczka replikacyjne.

ORI (Origins of replication)

Specyficzna sekwencja 200 pz jest minimalną sekwencja wymaganą

do inicjacji replikacji chromosomowego DNA.

    U ssaków inicjacja (ORI) obejmuje sekwencję 10 000 pz
    U roślin sekwencje  ORI nie są zidentyfikowane
    W chromosomach istnieje wiele potencjalnych ORI, ale nie

wszystkie funkcjonują w każdej komórce

Fragment DNA replikowany z jednego ORI nosi nazwę replikonu ( u

roślin długość replikonu to przeciętnie 50-70 kb)

Nie wszystkie ORI startują w tym samym momencie, jednak

porządek ich uruchamiania jest w komórkach ściśle kontrolowany i
zależy od stanu kondensacji chromatyny w danym miejscu.

I etap - Inicjacja

• replikacja rozpoczyna się w ściśle określonym miejscu, które
nazywa się origin (ori) lub (O) – specjalny odcinek o
specyficznej sekwencji nukleotydów (200-300par) (u
prokariotów 1 takie miejsce, u eukariontów wiele nawet kilka
tysięcy)
• w miejscach ori nici DNA pod wpływem białka
enzymatycznego

helikazy

rozdzielają się (rozrywanie wiązań

wodorowych) i tworzą tak zwane oczko replikacyjne. Replikacja
przebiega w 2 kierunkach, widełki replikacyjne przesuwaja się
w lewo i w prawo tak długo aż połączą się wszystkie oczka
replikacyjne.

• następnie syntetyzowane są krótkie (do 10 nukleotydów)
odcinki RNA tzw.

startery (primery)

przez enzym prymazę

prymazę

ponieważ enzym

polimeraza DNA

potrafi dobudowywać

trifosforany nukleozydów tylko do już istniejących fragmentów
dwuniciowych.

Kontrola inicjacji

• Licencjonowanie (kontrola pozytywna) –

zapewnia, że

chromosomy będą się replikować tylko wtedy, gdy w sposób
prawidłowy przejdą przez mitozę i znajda się w komórce
potomnej

• Aby nastąpiła inicjacja, do ORI musi się przyłączyć

Kompleks Rozpoznający Origin (ORC – Origin Recognition
Complex) i dodatkowe białka (czynniki licencjonujące Cdc-6
i Cdt-1) umożliwiające ścisłe pokrycie sąsiadującego DNA
białkami MCM (Minichromosome Maintenance). Tylko DNA
pokryty białkami MCM może być replikowany. Białka MCM
są usuwane przez przesuwające się widełki replikacyjne.

Negatywna kontrola inicjacji - Geminina

• Geminina – białko występujące w komórkach w

fazie G2

• Przeciwdziała przyłączaniu się białek MCM do

świeżo zreplikowanego DNA (zablokowanie
czynnika Cdt-1)

• Jest degradowana po zakończeniu mitozy
• Gemininy nie wykryto w drożdżach i roślinach!

II – Elongacja

• w widełkach replikacyjnych na nici o polarności 3`→5` powstaje
nowa nić o kierunku 5`→3` w sposób ciągły. Powstała nić potomna to
nić wiodąca.
• natomiast na nici 5`→3` syntetyzowane są krótkie (liczące około
kilkuset nukleotydów) odcinki w kierunku 5`→3` odcinki te nazwano
fragmentami Okazaki. Syntetyzowana nić to nić opóźniona.

III – Terminacja

• Zachodzi gdy z wszystkich widełek replikacyjnych zostają usunięte
startery (przez odpowiednie nukleazy). Polimeraza

Polimeraza

uzupełnia

brakujące odcinki DNA, a ligaza

ligaza

łączy fragmenty nici DNA.

• Następuje odłączenie kompleksu od nici DNA. Błędy replikacyjne
wyłapuje i naprawia polimeraza DNA

polimeraza DNA

. (replikacja DNA z

uwzględnieniem systemu korekty = 1 błędnie wstawiony nukleotyd
na miliard 1 000 000 000)

Telomery – końcowe odcinki DNA. Przy każdym podziale skracają się,
jak już skrócą się maksymalnie komórka przestaje się dzielić

Telomeraza

– enzym który wydłuża telomery przez co komórki mogą

się ciągle dzielić.

Szybkość replikacji

• Bakteria 1000pz/ sek

• Człowiek 100pz/ sek

Czas trwania replikacji całego DNA:

• Bakteria 40 min

• Komórki człowieka 6-12 godz.

Dokładność replikacji

• 1 błąd /miliard pz

• Polimeraza DNA wykazuje aktywność

korektorską

Liczba kopii powielanego fragmentu wzrasta wykładniczo 2

(n-liczba przeprowadzonych cykli powielania)

Zastosowanie reakcji PCR:
1)

diagnostyka chorób dziedzicznych oraz zakażeń
wirusowych i bakteryjnych

modyfikacja powielanej sekwencji poprzez użycie nie
całkiem komplementarnych primerów (tzw.
ukierunkowana mutageneza)

namnażanie DNA ze szczątków ludzi lub organizmów
wymarłych dawno temu

w kryminalistyce do identyfikacji ze śladów
pozostawionych na miejscu przestępstwa

w sądownictwie przy ustalaniu ojcostwa

do ilościowego oznaczania zawartości sekwencji
namnażanej matrycy w próbce

Document Outline