Wykład XV

Inżynieria genetyczna

Inżynieria genetyczna



Pod tym pojęciem rozumie się zabiegi

prowadzące do powstania nowych,

dziedzicznych właściwości organizmu.



Polegają na wprowadzeniu do komórek

biorcy ściśle określonych fragmentów

DNA (heterologicznych = obcych) w celu

wywołania trwałej zmiany w cechach

biorcy.



W tym celu inżynieria genetyczna stosuje

rekombinacje i klonowanie, a które

znalazły wiele zastosowań praktycznych

w biologii i medycynie i często zabiegi te

określa się również jako biotechnologia.



Rozwój genetyki molekularnej oraz
inżynierii genetycznej spowodował,
że bariery powstałe w wyniku
milionów lat ewolucji,
uniemożliwiające swobodne
krzyżowanie się pomiędzy
gatunkami zostały przełamane.



Stało się możliwe przenoszenie
genów z organizmów
eukariotycznych do
prokariotycznych, ze zwierząt do
roślin, od człowieka do bakterii, itd.

KLONOWANIE DNA



W klasycznym ujęciu klon rozumiemy jako

potomstwo 1 komórki z podziału

mitotycznego, ale w inżynierii genetycznej

i biotechnologii znaczy również populacje

identycznych odcinków DNA, czyli

powielone fragmenty DNA.



Klonowanie DNA może odbywać się na

dwóch poziomach:



- in vivo



- in vitro

Klonowanie DNA in vivo



polega na wprowadzeniu wybranego
odcinka DNA do szybko dzielących
się komórek, aby jednak nie uległo
ono lizie konstruuje się wektory
(„czysty DNA” zostałby rozłożony w
komórce biorcy).

Nośnikiem transgenu mogą być

cząsteczki DNA lub RNA
bakteriofagów lub DNA plazmidowy.



WEKTORY – DNA plazmidów lub
DNA i RNA wirusów + DNA
heterologiczmny. Bakteriofagi jak i
plazmidy mają właściwość
osłabiania ściany
i błony komórkowej w celu
uczynienia jej przepuszczalnej dla
cząstek DNA bakteriofagowego i
plazmidowego.

Wektor

wektory



-wektory bakteryjne – plazmidowe,

klonowanie fragmentów do 10 kpz



-wektory wirusowe: DNA fagów

(najczęściej są to fagi lambda – bardzo

wydajne gdyż można pakować w nie

duże odcinki DNA, do 18 - 25 kpz);

retrowirusy –RTV; adenowirusy – ADV



- kosmidy: plazmid bakteryjny +

sekwencja cos faga lambda (35-45 kpz)



WEKTORY ADENOWIRUSOWE

WEKTORY ADENOWIRUSOWE – ADV infekują

szeroki zakres komórek, w tym także komórki nie

dzielące się; nie integrują się z genomem

gospodarza; uzyskuje się wysoki poziom ekspresji

wprowadzanego genu, ale krótkotrwały.



WEKTORY RETROWIRUSOWE

WEKTORY RETROWIRUSOWE – RTV wbudowują

się w genom, stąd uzyskujemy długotrwałą

ekspresję transgenu, jednak integracja z

genomem może być przypadkowa, co wiąże się z

możliwością mutacji inercyjnych; wektory RTV

można wprowadzać tylko do komórek dzielących

się (błona jądrowa uniemożliwia integrację).



FAGI LAMBDA



– to najczęściej stosowane w inżynierii genetycznej

fagowe wektory. W całości fag ten nie nadaje się na

wektor gdyż posiada zbyt wiele miejsc

restrykcyjnych, dlatego też wycina się ok. 30% jego

genomu, natomiast pozostawia się sekwencje cos.



Fagi lambda posiadają cząsteczki DNA o długości

ok. 50 kpz, zawierają ok. 40 genów w cząsteczce,

budowa cząsteczki – liniowa, na końcach sekwencje

cos – 12-sto nukleotydowe, jednoniciowe, lepkie

końce wzajemnie komplementarne – dlatego u

bakterii fagi te stają się koliste. Właściwości te

wykorzystuje się przy konstrukcji tzw. kosmidów.

Prawidłowo skonstruowany
wektor powinien posiadać:



Sekwencje odpowiedzialne za inicjację

replikacji (tzw. ori)



Markery – geny odpowiedzialne za łatwo

wyróżnialne cechy fenotypowe (np.

oporność na antybiotyk, zdolność syntezy

określonego enzymu, zdolność świecenia

w odpowiednich warunkach) – geny te

nazywamy też genami reporterowymi



Polilinkery - odcinki DNA zawierające

sekwencje rozpoznawane przez różne

rodzaje restryktaz, co pozwala na łączenie

z wektorem fragmentów DNA strawionego

różnymi enzymami

Konstrukcja wektorów



Konieczne narzędzie to enzymy
restrykcyjne = endonukleazy restrykcyjne
= restryktazy → pozwalają wyizolować
pożądany fragment DNA;



restryktazy przecinają cząsteczkę DNA w
obrębie rozpoznanej sekwencji



powstają zawsze te same ilości określonych
fragmentów z danego genu;



w wyniku cięcia powstają lepkie końce (1-
no niciowe), które ligaza łączy
komplementarnie do siebie.

Konstrukcja wektorów



Powielanie (amplifikacja) DNA w
żywych komórkach czyli klonowanie
in vivo - wymaga czasu, musimy
uzyskać wiele pokoleń komórek,
aby osiągnąć pożądaną ilość kopii
DNA.

KLONOWANIE DNA IN VITRO



Jest wydajniejszą metodą, która daje

możliwość uzyskanie licznych kopii

DNA w krótkim czasie w warunkach

in vitro – w probówce.



Metoda ta to łańcuchowa reakcja

polimerazy PCR (Polymerase Chaim

Reaction)



opracowana w 1986 roku przez Kary

Mullisa, USA (Nagroda Nobla – 1993).

Łańcuchowa reakcja polimerazy
oparta jest na cyklicznych zmianach
temperatury.



PCR przeprowadza się w specjalnie
skonstruowanych aparatach, tzw.
termocyklerach.



Jest to urządzenie,



które umożliwia szybką

zmianę temperatur mieszaniny

reakcyjnej.

ETAPY AMPLIFIKACJI DNA
in vitro czyli PCR



1. Izolacja DNA



2. Oczyszczanie DNA



3. PCR:



-denaturacja DNA: wstępna i

właściwa



-przyłączanie starterów



-elongacja i elongacja

końcowa



4. Analiza produktu PCR

PCR

KLONOWANIE CAŁYCH
ORGANIZMÓW



polega na wytworzeniu kopii całego
organizmu wielokomórkowego na podstawie
materiału genetycznego znajdującego się w
DNA pojedynczej komórki somatycznej.



Jądro komórki somatycznej wprowadza się
do komórki, która wcześniej została
pozbawiona własnego jądra komórkowego, z
niej rozwija się zarodek, a z niego dojrzały
organizm.



W 1996 roku po raz pierwszy w
historii udało się sklonować ssaka-
owcę, którą nazwano Dolly. Do dziś
stworzono klony wielu innych
gatunków ssaków, m. in. myszy,
świń i krów.

Nie miała ojca, ale za to aż trzy
matki.



Jedna dała materiał genetyczny, druga -

komórkę jajową (a dokładniej - samą

cytoplazmę bez jądra), trzecia nosiła Dolly w

macicy, jako tzw. matka zastepcza.



"Główna matka", dawczyni materiału

genetycznego (uzyskanego z wymienia) w

chwili urodzenia się Dolly od dawna już nie żyła.

Imię zawdzięcza Dolly Parton,

amerykańskiej piosenkarce o
obfitym biuście.

Jak sklonowano owcę Dolly?

DOLLY STARA OD URODZENIA - 1999
rok



dokładne badania wykazały, że komórki
Dolly są starsze niż ona sama – o całe
sześć lat! Dlaczego?



Wiek komórki wyznaczają telomery



Pierwowzór Dolly, owca rasy Finn Dorset
miała 6 lat w momencie, kiedy pobierano
od niej komórkę do sklonowania.



To właśnie dlatego Dolly w momencie
urodzenia miała sześć lat.

DOLLY – WIERNA KOPIA MATKI?

(1999 rok)



W jądrze komórki znajduje się ok. 99,9%

informacji genetycznej, pozostałe 0,1% znajduje

się w mitochondriach.



Jaką informację genetyczną i od kogo zawierały

komórki Dolly?



OWCA 1 – rasy Finn Dorset – dawczyni

jądra komórkowego komórki somatycznej

(wymienia),



OWCA 2 – owca rasy Scottish Blackface-

dawczyni komórki jajowej, to jej

mitochondria znaleziono w komórkach

Dolly

CELE KLONOWANIA
ZWIERZAT
→



REPRODUKCJA (głównie powielanie

zwierząt transgenicznych)

oraz jako źródło KOMÓREK

MACIERZYSTYCH

Embrionalne komórki macierzyste
(potencjalnie mogą przekształcać się
w każdy rodzaj komórek)



w ten sposób będzie można w
przyszłości leczyć wiele
nieuleczalnych dzisiaj schorzeń,
jak choroba Alzheimera,
Parkinsona, cukrzycę, czy
uszkodzenia rdzenia kręgowego.



Przeciwnicy podkreślają problemy
etyczne jakie wiążą się z tymi
badaniami.

Istnieje potencjalna możliwość

odtworzenia przedstawicieli gatunków
zagrożonych wymarciem lub
wymarłych metodą klonowania i ich
reintrodukcja do środowiska
naturalnego

Czternaście sklonowanych świń
Sklonowane dzikie koty mają 'zwykłe'
potomstwo



Snuppy - pierwszy sklonowany pies

04.08.2005



Sklonowano konia wyścigowego

16.04.2005



Mięso i mleko ze sklonowanej krowy jest b

ezpieczne

- 12.04.2005



Klonowanie ludzkich embrionów

09.02.2005



Po raz pierwszy sklonowano owady

05.11.2004



Coraz bliżej sklonowania naczelnych

25.10.2004



Klonowanie mamuta-przywracanie gat.

wymarłych

GMO



ORGANIZMY MODYFIKOWANE

GENETYCZNIE

Organizmy zmodyfikowane
genetycznie (inaczej organizmy
transgeniczne)



to rośliny, zwierzęta i drobnoustroje

których geny zostały celowo zmienione

przez człowieka.



GMO - ORGANIZMY
DO GENOMU, KTÓRYCH WPROWADZONO
NOWY, HETEROLOGICZNY GEN,
PRZEKAZYWANY NASTĘPNYM
POKOLENIOM, ZGODNIE Z PRAWAMI
GENETYKI.

Organizmy zmodyfikowane
genetycznie (GMO)



*zawierają

wstawione

obce

geny

mogące pochodzić od nawet znacznie

odległych ewolucyjnie gatunków,



*w naturze geny te nie miałyby

możliwości wniknięcia do genomu

rośliny.



*Ogólniej, GMO to organizmy poddane

inżynierii genetycznej, w wyniku której

nastąpiły u nich takie zmiany w

genomie, jakie nie zdarzyłyby się w

wyniku rozmnażania czy rekombinacji.

Dotychczas uzyskano bardzo wiele
zmienionych genetycznie roślin, które
mogą służyć do produkcji żywności -



są to m.in. żyto, ziemniaki, buraki
cukrowe, kukurydza, pomidory, soja,
dynia, papryka, winogrona i banany,



Najwięksi producenci GMO: USA,
Kanadza, Argentyna, Brazylia, Chile,
Australia i Meksyk.

GMO to nie tylko owoce czy warzywa
-



organizmy transgeniczne lub

wytwarzane przez nie substancje

mogą stanowić także surowce do

produkcji dodatków bądź składników

żywności (maltodekstryna, lecytyna,

skrobia).



Modyfikowane rośliny mogą być także

wykorzystywane jako pasza lub jej

składnik w karmieniu trzody chlewnej

czy drobiu.



MODYFIKACJA GENOMU ROŚLIN W
CELU UZYSKANIA NOWYCH
KORZYSTNYCH CECH:



- tolerancja na herbicydy



- odporność na choroby wirusowe



- oporność na owady szkodniki



- oporność na zakażenia grzybicze



- jakość produktu

GMO



podwyższenie

trwałości

przechowywanych



podwyższenie tolerancji na zimno i
zamarzanie,



zmiana spektrum lipidów pod kątem
nasycenia kw. tłuszczowych,



zmiana proporcji cukru do skrobi w
różnych tk. roślinnych,



zmiany w składzie aminokwasów



Podwyższenie plonów



Zmniejszenie zanieczyszczenia
środowiska (herbicydami, środkami
ochrony roślin)



Podniesienie jakości produktów



Spadek cen produktów spożywczych



Tanie źródło białek
wykorzystywanych w medycynie

Metodyka transgenizacji komórek
roślinnych



Zastosowanie maja dwie metody:



bezpośrednie wprowadzenie DNA

protoplastów

przez

wstrzeliwanie



transformację za pośrednictwem

wektorów plazmidowych

TRANSGENIZACJA
BEZPOŚREDNIA



1. WSTRZELIWANIE DNA



wykorzystuje się w niej efekt
balistyczny przez zastosowanie
specjalnych działek, zwanych strzelbą
genetyczną, albo armatką genetyczną.



DNA przeznaczony do przeniesienia
opłaszcza się na mechanicznych
nośnikach z metali szlachetnych i
„wstrzeliwuje” do komórek
przeznaczonych do transformacji

Transformacja za pośrednictwem
wektorów plazmidowych
Agrobacterium



Do ich konstrukcji wykorzystuje się duże
plazmidy (Ti i Ri) bakterii z rodzaju



Rhizobium i



Agrobacterium (A. tumefaciens i A.
rhizogenes),



które posiadają naturalną zdolność do
wprowadzania swojego DNA do roślin.



Plazmidy te zawierają zakodowaną informację
o białkach niezbędnych do zaatakowania
rośliny.

Odporność na choroby powodowane
przez grzyby i bakterie



Odporność na grzybice i choroby

bakteryjne uzyskuje się poprzez

wprowadzenie transgenu kodującego

enzymy - hitynaza, glukanaza,



które niszczą ich ścianę komórkową.



Inny transformowany gen, koduje

osmotynę - białko wiążące się z błoną

komórkową powodując jej zniszczenie.

ROŚLINY OPORNE NA OWADY



CECHY TE OSIĄGNIĘTO

POPRZEZ:



- WPROWADZENIE GENU

KODUJĄCEGO INHIBITOR

PROTEAZ SERYNOWYCH



- WPROWADZENIE GENU

KODUJĄCEGO TOKSYNĘ

BACILLUS THURINGIENSIS



Rośliny transgeniczne



Zagrożenia:



-wbudowanie transgenów do
bakterii przewodu
pokarmowego ----- oporność na
antybiotyki



-przekazanie genu oporności na
herbicydy innym roślinom ----
katastrofa ekologiczna



-zmiana właściwości rośliny
transgenicznej poprzez
przypadkowe wbudowanie
transgenu, który uaktywni inne
geny lub je zinaktywuje



Rośliny transgeniczne są b. dobrze
przebadane, lepiej niż nowe
gatunki i odmiany nietransgeniczne

wprowadzane na
rynek

ywność GMO nie jest niezdrowa



„Według dzisiejszej wiedzy,
żywność zawierająca organizmy
genetycznie zmodyfikowane nie jest
dla zdrowia szkodliwa, ale
oczywiście wybór należy do
konsumenta”

GMO-zwierzęta



Pierwsze doniesienie o udanej próbie
transgenizacji pojawiło się w 1980r.



Była to mysz z genem wzrostu
szczura, i do tej pory służy jako
przykład doświadczenia modelowego.



Transgenizacja myszy była
przeprowadzona metodą

mikroiniekcji do przedjądrzy.

Transgenizacja zwierzat
hodowlanych



ma na celu głównie uzyskanie zwierząt o
pożądanych cechach w hodowli:



szybciej rosnące (zwiększenie masy ciała),



o wyższej wydajności mlecznej,



poprawa zdrowotności przez wprowadzenie
genów odporności lub tolerancji na
określone choroby



zastosowaniu ich do produkcji białek,
enzymów, innych substancji wykorzystanych
w przemyśle farmaceutycznym (jako
bioreaktory).

Uzyskanie szybszego wzrostu
zwierząt hodowlanych.



Modyfikacje polegające na

wprowadzeniu genów produkujących

hormon wzrostu.

W ten sposób modyfikowane były

głównie ryby: karpie, łososie, ale także

zwierzęta gospodarskie,
świnie, króliki, owce.

Produkcja białek heterologicznych o znaczeniu
terapeutycznym dla człowieka w gruczole
mlecznym zwierząt transgenicznych



Modyfikowane w tym celu są głównie krowy, kozy,

owce, gdyż pożądane białka wytwarzane są w

gruczołach mlecznych i wydzielane z mlekiem.



Produkowana jest antytrombina - ludzki enzym -

czynnik krzepliwości krwi, pozwala na kontrolę

powstawania zakrzepów,



produkcja antytrypsyny - stosowanej w leczeniu

rozedmy płuc, erytropoetyny - leczenie anemii.

Zwierzęta transgeniczne w
produkcji związków leczniczych



Króliki wykorzystywane są m.in. do
produkcji związków takich jak:
interleukina, czynnik IGF1, ludzki hormon
wzrostu, alfa-glukozydaza, czy białko C
biorące udział w krzepnięciu krwi.



Z mleka kóz uzyskuje się ludzką
antytrombinę.