Badanie czystości mikrobiologicznej produktów niejałowych

Mikrobiologiczna jakość preparatów

farmaceutycznych – rozdz. 5.1.4.

FPVIII

Produkty lecznicze niejałowe mogą zawierać
określoną liczbę drobnoustrojów i nie powinny
zawierać zdefiniowanych bakterii i niekiedy też
grzybów. Obecność nadmiernej liczby
drobnoustrojów i wydzielanych przez nie
enzymów a także obecność wykluczanych
bakterii może powodować:

•

zniszczenie produktu leczniczego

(substancji czynnej
lub postaci leku),

•  może prowadzić do obniżenia lub nawet
zniesienia
   leczniczego działania preparatu.

W związku z tym wytwórcy preparatów

leczniczych powinni zapewnić jak najmniejsze

zanieczyszczenie mikrobiologiczne produktu
leczniczego poprzez

wprowadzanie aktualnych

wytycznych Dobrej Praktyki Wytwarzania
(GMP).

Komisje trzech Farmakopei: Farmakopea

Europejska z Farmakopeą Japońską i F. Stanów
Zjednoczonych, w ramach nieformalnego układu
zwanego Grupą Dyskusyjną Farmakopei
postawiły sobie za cel opracowywanie
zharmonizowanych monografii i tekstów
podstawowych. Ponadto
uzgodniono procedurę nowelizacji, zgodnie z
którą wszystkie jednostki będą wprowadzały
zmiany jednocześnie.

Bardzo ważne w trakcie

harmonizacji jest więc poszukiwanie wyboru i
kompromisu.

Harmonizacja daje korzyści

•

uproszczenia i racjonalizacji metod

kontroli jakości i
   procedur dopuszczania produktów
leczniczych do
   obrotu,

• zmniejszeniem liczby badań kontrolnych
i tym samym
obniżeniem kosztów.

Bardzo istotną sprawą jest

wprowadzenie kryterium czystości
mikrobiologicznej dla wszystkich substancji
stosowanych w procesie wytwarzania
produktów leczniczych – substancji czynnych
oraz pomocniczych.

Przyjmuje się, że

czystość mikrobiologiczna dla danej
substancji jeżeli nie jest określona w
monografii szczegółowej, to powinna
odpowiadać kryterium podanemu końcowej
części tabeli 6.

Wprowadzane zmiany w badaniach
mikrobiologicznych i kryteriach akceptacji
dla produktów niejałowych, w pewnym
sensie wymuszone procesem harmonizacji,
powodują duże zamieszanie w przemyśle
farmaceutycznym i zmuszają do
podejmowania dodatkowych wysiłków i
czynności związanych z walidacją metod,
wprowadzaniem zmian w procedurach
analitycznych i dokumentacji
farmaceutycznej.

. Wprowadzono pełne nazwy podłóż (zamiast

liter),

. Wprowadzono jednoznaczne sformułowania, że

opisanych
metod nie stosuje się do produktów
zawierających zdolne do
życia drobnoustroje jako składniki czynne

. Alternatywne procedury mikrobiologiczne,

włącznie z
metodami zautomatyzowanymi mogą być
stosowane pod
warunkiem, że

zostanie wykazana ich

równoważność z
metodą farmakopealną.

. W przypadku metody oznaczania najbardziej

prawdopodobnej
  liczby (NPL), która jest  zasadniczo najmniej
dokładną
  metodą do określania liczby drobnoustrojów,
przyjęto w met.
  zharmonizowanej podejście, że w przypadku
niektórych grup

produktów z bardzo małym zanieczyszczeniem

mikrobiologicznym, NPL może być jednak
metodą
najbardziej właściwą.

Podczas badania żyzności, zamiast szczepu E.

coli stosuje się
P. aeruginosa. oraz włączono do testów C.
albicans

. Dokładnie określono techniki postępowania z

tzw. materiałem
siewnym. (drobnoustroje używane do
zaszczepiania powinny
pochodzić

z nie wyższego niż 5 pasaż

macierzystej serii
siewnej).

. Konieczność badania żyzności każdej serii

gotowego podłoża
i każdej serii podłoża (

zmniejszono nieco liczbę

komórek

drobnoustrojów w inokulum - nie więcej niż
100 CFU).

. Ze względu na duży błąd w wynikach testów

mikrobiologicznych zamiast pojęcie „walidacja
metody”,
zasadniczo

przyjęto określenie „przydatność

metody do
określonego celu”.

(taka przydatność metody

musi być
potwierdzona, jeżeli wprowadzi się zmianę w
metodyce
badania lub w produkcie, która może wpływać
na ten wynik.

Przyjęto następujące

kryterium akceptacji

dla jakości
   mikrobiologicznej:
   gdy kryterium jest 10 CFU, to maksymalna
dopuszczalna
   liczba koloni = 20; gdy  10² CFU, to
maksymalnie dopuszcza
   się 200 CFU, a gdy 10³ CFU, to maksymalna
dopuszczalna
   liczba to 2000 kolonii, itd.

. Wprowadzono nową kategorię produktu

leczniczego -

płyny

lub formy stałe w postaci aerozolu

. Określono sytuacje,

kiedy można prowadzić

badania na
zmniejszonej ilości produktu

a nie na

zazwyczaj przyjętej
   ilości, tzn. 10g lub 10ml produktu, 10
opakowań aerozoli, 10
   systemów transdermalnych. (w przypadku
produktów, gdzie
   ogólna liczba jednostek w serii jest mniejsza
niż 200 (badania
   kliniczne), wielkość próbki może być
zmniejszona do 2
   jednostek lub nawet 1 jednostki, jeżeli
wielkość serii jest
   mniejsza niż 100.

Wprowadzone zmiany harmonizacyjne
dotyczą również bardzo istotnej sprawy –

przyjęcia nowego podejścia w liczeniu
komórek bakterii i grzybów.

Pojęcie: ogólna liczba drobnoustrojów
tlenowych (

TAMC - total aerobic

microbial count

) oznacza liczbę kolonii

(CFU – colony forming unit) znalezionych
na podłożu agarowym z hydrolizatem
kazeiny i soi, przy czym jeżeli kolonie
grzybów są wykrywane na tym podłożu,
zaliczane są do części TAMC. Zasadniczo
jednak na podłożu tym rosną kolonie
bakterii, stąd liczba TAMC świadczy o
liczbie komórek bakteryjnych. Jeżeli liczba
drobnoustrojów jest określana metodą
najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL),
otrzymany wynik odpowiada liczbie
TAMC.

Pojęcie: ogólna, łączna liczba drożdży

i pleśni

(TYMC - total yeast/moulds count

) jest

równa liczbie kolonii znalezionych na
podłożu agarowym Sabouraud z
dekstrozą.

Jeżeli kolonie bakterii są wykrywane

na tym podłożu, zaliczane są do części
TYMC. W pewnych sytuacjach, gdy można
spodziewać się, że wartość TYMC
przekroczy przyjęte kryterium akceptacji
w związku ze wzrostem bakterii, można
użyć podłoże agarowe Sabouraud z
dekstrozą zawierające antybiotyki (nie
określono jakie antybiotyki i w jakim ich
stężeniu).

Tabela 6. Zharmonizowane kryteria akceptacji dla
mikrobiologicznej jakości produktów niejałowych i
substancji do celów farmaceutycznych (wg FP VIII)
część 1

----------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------
Droga

TAMC

-ogólna liczba

YMC

-ogólna

liczba

Drobnoustroje

podania

drobnoustrojów tlenowych pleśni i

drożdży

określone

CFU/g lub CFU/ml

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
----------

Preparaty doustne

10³ 10²

Nieobecność

nie zawierające wody

E.coli w 1 g/ml

----------------------------------------------------------------------
------------------

Preparaty doustne

10²

10¹

Nieobecność

zawierające wodę

E.coli w 1 g/ml

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
--

Podanie doodbytnicze

10³

10²

---------------------

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
----------

Podanie na śluzówkę

10²

10¹

Nieobecność

jamy ustnej, na dziąsła,
S.aureus i  P.aeruginosa
skórę, donosowo, do ucha
       w 1g/ml

Tabela 6. Zharmonizowane kryteria akceptacji dla
mikrobiologicznej jakości produktów niejałowych i
substancji do celów farmaceutycznych (wg FP VIII)
– część II

----------------------------------------------------------------------
-----------------
Podanie

dopochwowe

10²

10¹

Nieobecność

P.aeruginosa,

S.aureus,

C.albicans w 1g lub 1ml
--------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------
System transdermalny

10²

10¹

    Nieobecność
(wartość graniczna dla
P.aeruginosa, S.aureus,
plastra łącznie z warstwą
w jednym plastrze
adhezyjną i zewnętrzną
warstwą nośną)
--------------------------------------------------------------------------------------------------------
--------
Podanie wziewne (specjalne

10²

10¹

      Nieobecność
wymagania dla płynnych
P.aeruginosa, S.aureus,
preparatów do neubulizacji)
bakterie Gram- tolerujące
                                                                                                     żółć
w 1g/ml
--------------------------------------------------------------------------------------------------------
-------

Tabela 6. Zharmonizowane kryteria akceptacji....
Część III

--------------------------------------------------------------------
-----------------

Doustne postaci leku zawierają-

10 do 4

10²

Nie więcej niż 10²

cych surowce pochodzenia
CFU bakterii Gram-
naturalnego, których nie poddaje
tolerujących żółć w 1g
się wstępnej obróbce zmniejsza-
lub w 1ml, nieobecne
jącej liczbę drobnoustrojów i dla
Salmonella w 10g/ml,
których organ upoważniony
nieobecne E.coli i
dopuszcza TAMC surowców
S.aureus w 1g/ml
powyżej

10³ CFU w 1g/ml

-----------------------------------------------------------------------------------
--------

Ziołowe produkty lecznicze 10 do 7 10 do 5

Nie więcej niż 10²

zawierające wyłącznie 1 lub więcej
CFU E.coli w 1g/ml
Substancji roślinnych (w całości,
(załącznik)
w częściach lub sproszkowane):
ziołowe produkty lecznicze
poddawane przed użyciem
działaniu wrzącej wody;

Tabela 6.

Zharmonizowane kryteria akceptacji dla

mikrobiologicznej jakości produktów niejałowych i
substancji do celów farmaceutycznych (wg FP VIII)
–

Część IV

------------------------------------------------------------------------------------------------------
-
Droga podania

TAMC

-ogólna liczba

TYMC

-ogólna liczba

   Drobnoustroje
                                drobnoustrojów tlenowych  pleśni i
drożdży             określone
                                                      CFU/g lub CFU/ml
-----------------------------------------------------------------------------------
--------------------
Ziołowe produkty lecznicze        10 do 5           10 do4
   Nie więcej niż  niepoddawane przed użyciem
                          10² CFU bakterii

Gram- tolerujących
działaniu wrzącej wody;
żółć w 1g lub w 1ml

nieobecne E.coli w

1g/ml i Salmonella w

10g/ml
------------------------------------------------------------------------------------------------------
-------
Niejałowe substancje do

10³

10²

celów farmaceutycznych

Poza drobnoustrojami wymienionymi

w Tabeli oceniane jest także znaczenie
innych drobnoustrojów w zależności od

• użycia produktu: ryzyko różni się zależnie od
drogi i sposobu
podania (oko, nos, drogi oddechowe),

• właściwości produktu: jego zdolności do
podtrzymywania
wzrostu, obecność właściwej ochrony
przeciwdrobnoustrojowej,

•  docelowej grupy pacjentów: ryzyko różne dla
pacjentów
różnych grup (np. noworodków,  osób z
upośledzoną
odpornością, osób w podeszłym wieku),

• stosowania dodatkowego leczenia (np.
immunosupresyjnego,
przeciwzapalnego),

• występowania dodatkowych chorób, ran,
uszkodzeń
narządów.

Etapy badania czystości

mikrobiologicznej

Zakwalifikowanie preparatu wg FPVIII tom I (

5.1.4

Wybór metody badania,

Sprawdzenie jałowości

i żyzności podłoży

wykorzystywanych w badaniu,

Wykonanie badania

a/ Oznaczanie całkowitej liczby zdolnych do życia

drobnoustrojów tlenowych wg FPVII tom I

(

2.6.12

)

b/ Badanie obecności określonych drobnoustrojów

FPVIII tom I (

2.6.13

)

Wybór metody badania

Badanie metodą posiewu

bezpośredniego

Badanie metodą posiewu

bezpośredniego z zastosowaniem

substancji neutralizujących działanie

przeciwdrobnoustrojowe produktu

Badanie metodą filtracji

Przed przystąpieniem do badań należy

wybraną metodę zwalidować oraz

sprawdzić jałowość i żyzność podłoży

Sprawdzenie żyzności

podłoży

Szczepy testowe stosowane do badania

żyzności



Staphylococcus aureus jak ATCC 6538



Pseudomonas aeruginosa



Escherichia coli



Salmonella enterica ssp.enterica serotyp

typhimurium,



Salmonella enterica ssp.enterica serotyp serotyp

abony,



Candida albicans



Clostridium sporogenes

Wykonanie badania

Przygotowywanie próbek

Próbki należy pobierać według odpowiednio opracowanego

planu, który powinien uwzględniać m.in.:



wielkość serii,



charakterystykę produktu:

1. produkt rozpuszczalny w wodzie,

2. produkt niezawierający tłuszczów,

3. produkt nierozpuszczalny w wodzie,

4. produkty

4. produkty zawierające

tłuszcze,

5. płyny lub formy stałe w postaci aerozolu,

6. systemy transdermalne)



spodziewany poziom zanieczyszczenia.

Przygotowywanie próbek –

cd.

10 g lub 10 ml badanego preparatu do badań w

kierunku całkowitej liczby zdolnych do życia

drobnoustrojów tlenowych oraz badanie obecności:



bakterii Gram-ujemnych

tolerujących żółć,



E. coli,



Salmonella,



P. aeruginosa



S. aureus



Clostridia,



Candida albicans

należy rozpuścić lub zawiesić w zbuforowanym

roztworze chlorku sodu z peptonem o pH 7,0 w

objętości 100 ml

Oznaczanie całkowitej liczby

zdolnych do życia

drobnoustrojów tlenowych

Całkowitą liczbę zdolnych do życia

drobnoustrojów tlenowych (bakterii i grzybów)

oznaczamy w odniesieniu do 1g lub 1 ml

badanego produktu, korzystając z próbki

przygotowanej w zbuforowanym roztworze

chlorku sodu z peptonem o pH 7,0.

Odpowiednią

ilość posiewamy w kierunku:



bakterii

agar z hydrolizatem kazeiny i

soi

temp. 30-35





grzybów na agar Sabouraud- temp.

20-25





inkubacja przez 5 dni

Oznaczanie całkowitej liczby zdolnych

do życia drobnoustrojów tlenowych –

cd.

Oznaczenie to można wykonywać

metodą posiewu bezpośredniego:



technika płytek lanych,



technika posiewu

powierzchniowego.

metodą z użyciem sączków

membranowych

metoda oznaczenia najbardziej

prawdopodobnej liczby - NPL

Metodą oznaczania najbardziej

prawdopodobnej liczby (NPL) - metoda ta

polega na przygotowaniu serii co najmniej

trzech 10-krotnych rozcieńczeń produktu, z

których pobiera się próbkę 1 ml, posiewa do

bulionu z hydrolizatem kazeiny i soi Jeśli to

konieczne można dodać do podłoża związek

powierzchniowo-czynny taki jak polisorbat

80 lub substancję neutralizującą czynniki

przeciwdrobnoustrojowe. Wszystkie

probówki inkubuje się w temperaturze 30-



C nie dłużej niż 3 dni; następnie

odnotowuje się liczbę próbek, w których

wykazano wzrost drobnoustrojów i wynik

interpretuje się wg tabeli zamieszczonej w

FP.

W przypadku niektórych grup

produktów z bardzo małym
zanieczyszczeniem mikrobiologicznym, NPL
może być jednak metodą najbardziej
właściwą.

Badanie nieobecności bakterii

Gram-ujemnych, tolerujących żółć



Z próbki przygotowanej w

Z próbki przygotowanej w bulionie z

hydrolizatem kazeiny i soi po reaktywacji przez

2 godz.

pobrać ilość odpowiadającą 1 g lub 1 ml

produktu wprowadzić do płynnego bulionu

Mossela wzbogaconego dla pałeczek

jelitowych),



inkubować 24-48 h w temperaturze 30-35





przesiać na agar z fioletem krystalicznym,

czerwienią obojętną, żółcią i glukozą,

inkubować 18-24 h w temperaturze 30-35



Produkt spełnia wymagania jeśli nie

obserwuje się wzrostu kolonii.

Badanie

Badanie ilościowe w kierunku bakterii

Gram-ujemnych, tolerujących żółć



Z próbki przygotowanej w bulionie z hydrolizatem

kazeiny i soi po reaktywacji przez okres 2

godz.pobrać ilość odpowiadającą 0,1 g, 0,01 g,

0,001 g (lub 0,1 ml; 0,01 ml; 0,001 ml) i wprowadzić

do bulionu Mossela, inkubować 24-48 h w

temperaturze 30-35C.



przesiać na płytki agarowe z fioletem krystalicznym,

czerwienią obojętną, żółcią i glukozą, inkubować

18-24 h w temperaturze 30-35C.

Odnotować najmniejszą ilość produktu, dla

której otrzymano wynik dodatni, oraz

największą ilość produktu, dla której

otrzymano wynik ujemny.

Prawdopodobną liczbę

bakterii należy odczytać z tabeli zamieszczonej w FP.

Wyniki dla

każdej

produktu

ilości

Prawdopodob

na liczba

bakterii w g

lub ml

produktu

0,1g lub
0,1ml

00,1g lub
0,01 ml

0,001g

lub

0,001 ml

>10³

<10

³ i >10²

<10

² i >10

<10

Interpretacja wyników

oznaczenie prawdopodobnej liczby bakterii

Badanie obecności

E. coli



Z próbki w zbuforowanym roztworze chlorku

sodu pobrać ilość odpowiadającą 1 g lub 1 ml

i zaszczepić 100 ml bulionu z hydrolizatem

kazeiny i

kazeiny i soi



inkubować 18-24 h w temperaturze 30-35





wymieszać i przenieść 1 ml do bulionu

MacConkeya,



inkubować 24-48 h w temperaturze 42-44





przesiać na płytki z agarem MacConkeya i

inkubować 18-72 h w temperaturze 30-35



Wzrost kolonii świadczy o możliwej obecności

coli.

Wynik potwierdzić badaniami identyfikacyjnymi

Badanie obecności

Pseudomonas

aeruginosa



Z próbki w zbuforowanym roztworze chlorku

sodu pobrać ilość

sodu pobrać ilość odpowiadającą

1 g lub 1 ml i

zaszczepić 100 ml bulionu z hydrolizatem

kazeiny i soi,



inkubować 18-24 h w temperaturze 30-35





przesiać na płytkę agaru z cetrymidem.



inkubować 18-72 h w temperaturze 30-35





Wzrost kolonii świadczy o możliwej obecności

Pseudomonas aeruginosa

Produkt spełnia wymagania jeżeli nie

obserwuje się pojawienia kolonii lub gdy

badania identyfikacyjne są ujemne.

Badanie obecności

Staphylococcus

aureus



Z próbki w zbuforowanym roztworze chlorku

sodu pobrać ilość odpowiadającą 1 g lub 1 ml i

zaszczepić 100 ml bulionu z hydrolizatem

kazeiny i soi,



inkubować 18-24 h w temperaturze 30-35





przesiać na płytkę agaru z mannitolem i

chlorkiem sodu, inkubować 18-72 h w

temperaturze 30-35



Na prawdopodobna obecność S.aureus wskazują

żółte/białe kolonie otoczone żółtą strefą.

Wynik potwierdzić badaniami

identyfikacyjnymi

Badanie obecności

Salmonella



Z próbki przygotowanej w bulionie z

hydrolizatem

kazeiny

i soi),

po 24 h

inkubacji przenieść 1 ml do 10 ml bulionu

Rappaporta Vassiliadisa wzbogaconego dla

Salmonella, inkubować 18-24 h w

temperaturze 30-35





przesiać na płytkę agaru z ksylozą, lizyną i

deoksycholanem, inkubować 18-48 h w

temperaturze 30-35



Wzrost charakterystycznych czerwonych kolonii

z czarnymi środkami lub bez nich wskazuje na

prawdopodobną obecność

Salmonella

2. Wynik potwierdzić badaniami identyfikacyjnymi

Badanie w kierunku Candida albicans



Z próbki w zbuforowanym roztworze

chlorku sodu pobrać ilość

odpowiadającą 1 g lub 1 ml i dodać do

100 ml bulionu Sabouraud z dekstrozą

i zamieszać,



inkubować 3-5 dni w temperaturze

30-35





przesiać na płytkę z agarem

Sabouraud z dekstrozą i inkubować

24-48 h w temperaturze

30-35



Wzrost białych kolonii może wskazywać

na obecność

C.albicans

Wynik potwierdzić badaniami

identyfikacyjnymi

Document Outline