Metody uzyskiwania

chromosomów 

człowieka

i analiza

 

 

MATERIAŁ BIOLOGICZNY          

   DO HODOWLI 

CHROMOSOMÓW



pełna krew obwodowa



komórki płynu owodniowego – amniocyty



komórki kosmówki (trofoblastu)



krew pępowinowa



tkanki poronionego zarodka



fibroblasty skóry



komórki nowotworowe z wysiękowych 
płynów nowotworowych (np. z jamy 
otrzewnej, opłucnej)

 

 



fragmenty tkanek guzów nowotworowych 
pobrane po operacji



komórki nowotworowe pobrane metodą 
biopsji cienkoigłowej



szpik kostny (komórki nowotworowe 
pochodzące     z biopsji szpiku)

 

 

POBIERANIE MATERIAŁU          

     DO BADAŃ 

CYTOGENETYCZNYCH

Materiał do badań musi być pobrany jałowo.
Musi być umieszczony w sterylnym, 

zamykanym pojemniku.



Krew pobiera się na heparynę z żyły 

łokciowej, nie może zawierać skrzepów.



Komórki płynu owodniowego są 

uzyskiwane przez amniopunkcję:



wczesną – 12-14 tydzień ciąży



późną – 15-17 tydzień ciąży

 

 



Komórki trofoblastu uzyskuje się z kosmówki za 

pomocą biopsji przez powłoki brzuszne, rzadziej 

przez szyjkę macicy, między 8 a 11 tygodniem ciąży.



Komórki szpiku kostnego pobiera się przez nakłucie 

mostka lub talerza kości biodrowej (u dzieci). 
Bioptat szpiku wprowadza się natychmiast do 

jałowej próbówki zawierającej ogrzany do 37

o

C płyn 

hodowlany.

Pojemniki zawierające próbki tkanek do badań muszą być 

oznaczone co najmniej dwoma danymi 

identyfikacyjnymi pacjenta (np. imię i nazwisko oraz 

data urodzenia).

 

 

OPTYMALNE ILOŚCI MATERIAŁU DO 
BADAŃ:



KREW ŻYLNA

2-10 ML



KREW PĘPOWINOWA  2-10 ML



PŁYN OWODNIOWY

15-20 ML



KOSMÓWKA

10-20 MG



SZPIK KOSTNY

1-2 ML

 

 

PRZECHOWYWANIE I TRANSPORT

Czas przechowywania należy ograniczyć do minimum.

Krew

 – 24 godziny w temperaturze pokojowej, lub 3 

doby w temp. poniżej 4

o

C.

Płyn owodniowy

 – nie dłużej niż 24 godziny w temp. 

+4

o

C.

Świeże tkanki umieszczone w pożywce

 – do 3 dni w 

temp. +4

o

C.

Tkanki najlepiej jest zaraz po pobraniu umieszczać        

            w pojemnikach z podłożem hodowlanym.

Transport tkanek powinien odbywać się w pojemnikach 

           z podłożem lub bez podłoża w temp. 0

o

C

 

 

HODOWLA CHROMOSOMÓW

(IN VITRO)

Z LIMFOCYTÓW 

KRWI OBWODOWEJ

 

 

SKŁADNIKI:

a)

podłoże Eagle’a

b)

fitohemaglutynina M (PHA)

c)

sól sodowa heparyny

d)

płodowa surowica cielęca

e)

penicylina krystaliczna

f)

streptomycyna

g)

Colcemid (kolchicyna)

h)

KCl – 0,075 M

i)

płyn Carnoy’a

j)

barwnik Giemsy

 

 

PRZYGOTOWANIE PŁYNU 

HODOWLANEGO

Do sterylnej butelki odmierzamy 100 ml 
płynu Eagle’a, dodajemy:



fitohemaglutyninę M 

– stężenie 1%



penicylinę krystaliczną  – stężenie 100 IU / 

ml



streptomycynę 

– stężenie 100 

g/ml

 

 

ZAKŁADANIE I PROWADZENIE 

MAKROHODOWLI

Hodowlę komórkową zakładamy w 
sterylnych jednorazowych naczyniach 
hodowlanych NUNC o pojemności 25 
ml w warunkach jałowych (komora 
laminarna).

 

 

a)

do sterylnej próbówki z 1 ml heparyny 
(stężenie – 50IU / 1 ml krwi) pobieramy 
od pacjenta 10 ml krwi żylnej 
odstawiamy na ok. 2 godz. do 
sedymentacji w temperaturze 
pokojowej.

 

 

b)

pobieramy osad krwinek białych wraz 
z 1 ml osocza, przenosimy do naczynia 
hodowlanego z 8 ml wyżej opisanego 
płynu hodowlanego, dodajemy 1 ml 
surowicy płodowej cielęcej. 
Naczynie szczelnie zamykamy. 
Końcowa objętość hodowli wynosi 10 
ml.

 

 

c)

przenosimy naczynko hodowlane do 
cieplarki i prowadzimy hodowlę w temp. 
37

o

C przez 48-72 godz.

Każdego dnia hodowlę dokładnie 
mieszamy.

d)

na 2 godziny przed zakończeniem  
hodowlę wyjmujemy z cieplarki, dodajemy 
Colcemid (kolchicyna) w stężeniu 0,15 
g / ml i ponownie wstawiamy do cieplarki 

na ostatnie 2 godz.

 

 

WYKAŃCZANIE HODOWLI

a)

wyjętą z cieplarki zawartość naczynka 
hodowlanego przelewamy do sterylnych 
próbówek wirowniczych, wstawiamy do 
wirówki, wirujemy 7 min, 800 obr. / min.

b)

zlewamy płyn znad osadu, próbówkę 
wstrząsamy i dodajemy do osadu kroplami 
10 ml 0,075 M KCl (0,55% KCl). 
Pozostawiamy na 17 min. w temp. 
pokojowej, wirujemy 7 min, 800 obr. / min.

 

 

c)

zlewamy płyn znad osadu, a do osadu 

dodajemy ok. 10 ml płynu Carnoy’a 

(mieszanina metanolu i kwasu octowego 

lodowatego w proporcji 3:1). 
Próbówki umieszczamy w lodówce na 10 min.
Wirujemy 7 min, 800 obr. / min – czynność 

powtarzamy 3-krotnie.

d)

po ostatnim wirowaniu zlewamy płyn znad 

osadu, a osad nakraplamy na oziębione 

szkiełka podstawowe.

e)

po wysuszeniu preparaty barwimy barwnikiem 

Giemsy.

 

 

ZAKŁADANIE I PROWADZENIE 

MIKROHODOWLI

Mikrohodowla stosowana jest powszechnie 
w rutynowej diagnostyce noworodków i 
małych dzieci.



odczynniki - jak w makrohodowli.



przygotowanie płynu hodowlanego – 
jak w makrohodowli.

 

 

 

Mikrohodowlę zakładamy w wysterylizowanych 
buteleczkach po penicylinie o pojemności 5 ml 
lub       w naczynkach plastikowych.

Do 2 ml płynu hodowlanego dodajemy 4 krople 
(0,3 – 0,5 ml) pełnej krwi (pobranej z pięty lub 
żyły ciemieniowej).

Hodowlę prowadzi się przez 72 godziny wg 
tych samych procedur jak w przypadku 
makrohodowli.

 

 

HODOWLA CHROMOSOMÓW

(IN VITRO)

Z KOMÓREK 

SZPIKU KOSTNEGO

 

 

Bioptat szpiku (1-2 ml) należy wprowadzić 
natychmiast do uprzednio przygotowanej 
jałowej próbówki, zawierającej ogrzany do 
37

o

C płyn hodowlany, np. RPMI 1640 z 

dodatkiem 15% płodowej surowicy cielęcej 
oraz antybiotyki (penicylinę, 
streptomycynę) w standardowych 
stężeniach. Dodatkowo próbówka powinna 
zawierać heparynę w stężeniu 250 IU/ml

ZAKŁADANIE I PROWADZENIE 

HODOWLI

 

 

Są dwie drogi postępowania

A.

Metoda uzyskiwania chromosomów 
bezpośrednio po pobraniu komórek 
ze szpiku kostnego.

B.

Metoda krótkotrwałej hodowli.

 

 

METODA BEZPOŚREDNIA

Polega na inkubacji komórek szpiku przez 
1-2 godziny w pożywce zawierającej 
kolcemid (25 g/ml)

Postępowanie jest zalecane w ostrych 
białaczkach szpikowych i limfatycznych

 

 

METODA KRÓTKOTRWAŁEJ 

HODOWLI

Hodowlę komórkową zakładamy w wyżej 
opisanym płynie hodowlanym stosując 
rozcieńczenie zawiesiny komórek szpiku 
kostnego – 1 milion na ml hodowli.

 

 

 



Komórki hoduje się najczęściej przez okres 24 lub 48 

godzin w cieplarce w temp. 37

o

C i 5% stężeniu CO

2

.



Mitozy blokuje się Colcemidem o stężeniu 5-10 g/ml 

na okres 45-60 min. przed zakończeniem hodowli.



Szok hipotoniczny w celu odpowiedniego rozproszenia 

chromosomów w jądrze przeprowadza się 0,4% 

roztworem KCl lub mieszaniną o składzie: 



3,0 g KCl



4,8 g HEPES 



0,2 g EGTA

w 1000 ml wody o pH 7,4.

 

 



Dalsze etapy utrwalania i wykańczania hodowli 
w obu metodach są podobne jak w 
standardowych technikach cytogenetycznych.



W przypadku białaczek, gdy komórki 
nowotworowe znajdują się  we krwi 
obwodowej, stosuje się 24-48 godzinne 
niestymulowane mitogenami hodowle komórek 
pobranych drogą nakłucia żylnego.



Zasady barwienia chromosomów komórek 
szpiku są takie same, jak chromosomów 
uzyskanych z innych tkanek człowieka.

 

 

HODOWLA CHROMOSOMÓW

(IN VITRO)

Z TKANEK POCHODZĄCYCH  

Z GUZÓW NOWOTWOROWYCH

 

 

Transport guza



jałowe naczynie



płyn Hanksa lub Eagle’a lub 
0,9% NaCl + antybiotyki: penicylina 

krystaliczna (100 IU / ml), streptomycyna (100 

g / ml)

Przygotowanie tkanek guza



1-3 cm

3

 tkanki guza przenosimy na szalkę 

Petriego



rozdrabniamy tkankę guza nożyczkami



dodajemy 2 ml płynu Hanksa z antybiotykami i 

dalej rozdrabniamy.

 

 

Skład płynu hodowlanego:



płyn RPMI z penicyliną (100 IU/ml) i 
streptomycyną (100 g / ml)



10-15 % v/v surowica płodowa cielęca



1 ml L-glutaminy 

Przeniesienie tkanki guza do naczynka 

hodowlanego NUNC, 

w którym znajduje się:



5 ml płynu hodowlanego 



1 ml kolagenazy o stężeniu 150-200 IU/ml

 

 

Całość pozostawiamy w cieplarce (37

o

C, 5% 

CO

2

, 24 h)



po 24 godzinach rozpipetowujemy



przenosimy materiał do dużej próbówki 
wirowniczej



dodajemy 10 ml płynu RPMI z antybiotykami



zamykamy i wirujemy 10 min, 1000 obr./min



po odwirowaniu dodajemy 1,5 ml płynu RPMI

 

 

ZAKŁADANIE I PROWADZENIE 

HODOWLI

Zakładanie hodowli



Naczynie szklane:

 

•

8,5 ml płynu hodowlanego

•

1,5 ml zawiesiny komórek guza



Naczynie plastikowe:

 

•

4,5 ml płynu hodowlanego

•

0,5 ml zawiesiny komórek guza

Hodowlę prowadzimy w cieplarce w temp 37

o

C, z 

przepływem 5% CO

2

.  

Codziennie oglądamy w mikroskopie odwróconym 

wzrost hodowli.

Uwaga: co 2-3 dni zmieniamy płyn hodowlany.

 

 

Zakończenie hodowli



Przy widocznych mitozach (po kilku, 

kilkunastu dniach i więcej), na okres od 30 

min do 2 godz. przed zakończeniem hodowli 

dodajemy Colcemid w stężeniu 5-10 g/ml.



Następnie zdrapujemy „drapaczką” komórki 

hodowli.



Całość zlewamy do próbówek wirowniczych



Wirujemy 10 min. 1100 obr./min

 

 

Przeprowadzenie szoku hipotonicznego

Skład płynu hipotonicznego



KCl

- 1,5 g



HEPES - 

2,4 g



EGTA - 0,1 g



500 ml dejonizowanej H

2

O

pH = 7,4 doprowadzić NaOH  HCl 
Szok hipotoniczny prowadzimy w temp. 37

o

C, 

45 min.

Wirujemy 10 min 1100 obr. / min

 

 

Utrwalanie materiału komórkowego



metanol (cz.d.a.) : lodowaty kwas octowy 
(cz.d.a.) w proporcji 3:1



czynność powtarzamy 3-krotnie przez 20 
minut



wirowanie – 10 min, 1100 obr./min



nakrapianie na zimne (wyjęte z wody z 
lodem) szkiełka podstawowe.

 

 



Szybki wzrost komórek:



możliwość zahamowania kontaktowego 
wzrostu



wykonujemy wtedy pasażowanie w 
użyciem roztworu trypsyny i zakładamy 
2 hodowle z 1



Brak przyczepu komórek do ścianki 
naczynia hodowlanego:



zakładamy ponownie hodowlę w 
buteleczkach      z Vitrogenem 
(Kollagen)

Dodatkowe czynności, które mogą 
być wykonane w czasie 
prowadzenia hodowli:

 

 



Nadmiar erytrocytów:



Płuczemy komórki hodowlane w płynie 

niszczącym erytrocyty



Bufor do rozpuszczania erytrocytów:

•

NH

4

Cl -

8,29 g

•

KHCO

3

-

1,0 g

•

EDTA - 0,0371 g

Rozpuścić w 1000 ml H2O destylowanej
Bufor wstawić do autoklawu na 15 min.

 

 

Budowa nukleosomu 

DNA

histon H1

8 cząsteczek histonów 
rdzeniowych

Nukleosom

 

 

11nm

30nm

300nm

700nm

1400nm

2nm

Skondensowany fragment 
chromosomu metafazowego - 
minipasmo

Fragment podwójnej helisy 
DNA

Nukleosomy  

Włókno chromatynowe 
(solenoid) z upakowanych 
nukleosomów

Fragment „rozwiniętego” 
chromosomu - pętle

Chromosom 
metafazowy

Alberts, et al. Molecular Biology of the Cell, 3rd edn

2 

nm

10 

nm

30 

nm

300 

nm

700 

nm

1400 

nm