METODY OTRZYMYWANIA I OCZYSZCZANIA PREPARATOW WIRUSOWYCH

METODY OTRZYMYWANIA I

OCZYSZCZANIA PREPARATOW

WIRUSOWYCH

Dr n. wet Łukasz Adaszek

Wydź. Med. Wet. Lublin

Klinika Chorób Zakaźnych

By otrzymać preparat wirusologiczny,

pobrany materiał musi zostać
poddany całemu szeregowi zabiegów
mających na celu:

• usunięcie bakterii i grzybów
• ich enzymów i toksyn
• innych substancji inhibitujących

(egzonukleazy)

• Oczyszczanie i zagęszczanie prepartów

wirusowych nie jest najczęściej
procesem jednoetapowym.

• Bardzo trudno jest także otrzymać

zupełnie czysty preparat.

• Za kryterium czystości uznaje się

jednolity wygląd preparatu w
mikroskopie elektronowym lub brak
możliwości usunięcia zanieczyszczeń
bez zmniejszenia właściwości
zakaźnych oczyszczonych wirionów

Pierwszym etapem prowadzącym do

otrzymania czystego preparatu

wirusowego jest jałowe pobranie

materiału, a następnie poddanie go

działaniu:

• antybiotyków
• substancji bakteriostatycznych
• lub mechaniczne oczyszczanie( filtry,

wirowanie itp.)

• Dalsze postępowanie uzależnione

jest w jakim kierunku mają zmierzać
badania. Obecnie firmy obsługujące
laboratoria biologii molekularnej
oferują zestawy zawierające
odpowiednie enzymy i bufory tzw.
„kity” służące do izolacji wirusa z
odpowiedniego materiału, niekiedy
bardzo zanieczyszczonego

• Należy jednak zaznaczyć, że czystość

preparatu wirusowego w głównej mierze
zależy od staranności i precyzji osoby
wykonującej badanie.

• Jeżeli punktem wyjścia do otrzymania

preparatu wirusologicznego ma być
zakażona hodowla komórek należy
odpowiednio przygotować zarówno
materiał którym będziemy zakażać jak i
linie komórkowe.

Hodowle komórkowe

• Prowadzenie hodowli komórek wymaga

odpowiedniej metodyki jak i sprzętu.

• Przechowywanie: ciekły azot.

• Rozmrażanie jak i późniejsze pasaże -

warunki jałowe (pod specjalnymi komorami).

• Środowiskiem wzrostu komórek są specjalne

płyny np. EMEM zawierające antybiotyki oraz

surowicę.

• Hodowlę prowadzi się w specjalnie do tego

celu przeznaczonych dołkach lub butelkach

w temp. 37*C w środowisku 5% CO2.

Hodowle komórkowe

• Jeżeli jest ona przeprowadzona

prawidłowo i nie doszło do zakażenia
komórek innymi drobnoustrojami,
komórki formują tzw. confluent.

•Pokrycie 80% powierzchni dna butelki

przez komórki jest najbardziej

odpowiednim do zakażenia takiej hodowli,

a następnie obserwacji zmian jakie w niej

wywołuje obecność wirusa (wakuolizacja,

rozpad jąder komórkowych, całkowita

destrukcja komórek).

• Zakażenie należy wykonać także w

warunkach jałowych używając
jednorazowego sprzętu. Otrzymany
w ten sposób preparat obserwuje się
przez kolejne dni w celu wykazania
efektu cytopatycznego. Jego
nasilenie jak i czas w którym
występuje po zakażeniu zależy od
miana użytego do zakażenia wirusa.

Preparaty odciskowe

• Umożliwiają one bezpośrednie

wykrycie wirusa oraz wskazanie na

niego jako przyczynę schorzenia.

• Można je pobierać przyżyciowo jak np.

u człowieka w przypadku wścieklizny z

rogówki oka, komórek mieszków

włosowych, skóry podbródka lub

karku, lub pośmiertnie u zwierząt w

przypadku wścieklizny z mózgu.

Preparaty odciskowe

• Ciałka wtrętowe jak i elementy wirusa uwidaczniają

się w preparatach odciskowych w następstwie

barwienia lub reakcji antygenów wirusowych z

przeciwciałami fluoryzującymi.

• W przypadku nosówki psów preparaty odciskowe

pobieramy ze spojówki, lusterka nosa lub błony

śluzowej pochwy bądź napletka. Następnie są one

suszone po czym inkubowane w acetonie, którego

zadaniem jest oczyszczenie jak i odtłuszczenie

preparatu.

• W przypadku nosówki elementy wirusa obecnego w

preparatach odciskowych uwidaczniają się w

mikroskopie immunofluoroscencyjnym pod

powiększeniem 40x.

Preparaty odciskowe

• szkiełko pokrywamy koniugatem CDV,

który przyłączy się do wirusa
uwidaczniając jego elementy w obrazie
mikroskopowym.

• Kolejne płukania szkiełka w roztworach

PBS mają zadanie usunąć ewentualne
zanieczyszczenia oraz zapewnić
odpowiednie środowisko reakcji.

• Po wysuszeniu preparat oglądamy pod

mikroskopem.

• Badania wirusologiczne wymagają

odpowiednio czystych i
zagęszczonych zawiesin wirusa.
Materiałem wyjściowym są zazwyczaj
zakażone komórki lub płyny, lub
narządy wewnętrzne.

• Pierwszym etapem jest uwolnienie

wirusa z zakażonych komórek.

Dokonać tego można metodami:
• mechanicznymi (rozcieranie, użycie

homogenizatorów)

• poprzez zamrażanie
• poprzez trawienie enzymatyczne

W dalszych etapach oczyszczanie

preparatów wirusowych dokonuje się
poprzez:

• Wytrącanie
• wirowanie bądź ultrawirowanie
• metodami adsorbcyjnymi
• metodami chromatograficznymi

WYTRĄCANIE

• Najczęściej do tego celu stosuje się

etanol, a także siarczan amonu,
sodu, glikol, aceton itp. Można
stosować wytracanie izoelektryczne,
przy zastosowaniu takiego ph przy
którym wirus traci ładunek
elektryczny. Następnie wytrącone
wiriony odwirowuje się i poddaje
dalszym etapom oczyszczania

WIROWANIE

• Pozwala ono oddzielić wiriony od innych tkanek.

Wirowanie różnicowe polega na stosowaniu

naprzemiennie wysokich i niskich obrotów. Efektem

takiego wirowania jest usuniecie początkowo

cząstek o większym ciężarze od cząstek wirusa, a

następnie samych wirionów.

• Dokładniejszą metodą oczyszczania preparatów

jest wirowanie w strefowym gradiencie stężeń lub

w równoważnym gradiencie stężeń. W pierwszej

metodzie zawiesinę wirusa umieszczamy na

powierzchni r-tw. sacharozy lub glicerolu o liniowym

gradiencie gęstości, wirujemy 2h przy 70-170 x g.

Wiriony w postaci opalizującej warstwy umieszczają

się na poziomie gradientu równemu ich gęstości.

WIROWANIE

• Wirowanie w równoważnym

gradiencie stężeń polega na
wprowadzaniu zawiesiny do r-tw.
chlorku cezu, siarczanu rubidu,
bromku potasu 6-9M. W czasie
wirowania wiriony przemieszczają się
do punktu, w którym ich gęstość jest
równa gęstości roztworu. Frakcję tą
pobiera się nakłucie probówki.

METODY ADSORPCYJNE

• Polegają na wiązani wirusów przez krwinki czerwone

(Ortomyxoviridae), adsorbanty chemiczne(kaolin,

NaOH, fosforan glinu), a także surowice

odpornościowe. Adsorbcja wirusa do krwinek

zachodzi w temp. 4*C. Stosuje się krwinki kurze lub

ludzkie grupy 0. Elucja wirusa z krwinek zachodzi w

temp. 37*C, i przy zastosowaniu niskoobrotowego

wirowania oddziela się krwinki od wirionów.

Oddzielenie wirusa od adsorbenta chemicznego

dokonuje się przez zmianę ph roztworu lub siły

jonowej. Przeciwciała z kolei oddziela się od

wirionów przez zmianę warunków

fizykochemicznych lub trawienie enzymatyczne

przeciwciał.

METODY

CHROMATOGRAFICZNE

• Chromatografia kolumnowa polega na

wiązaniu się wirusa np. z
dietyloaminoetylocelulozą (DEAE) lub
fosfocelulozą. Następnie wirus wymywany
jest przez zmianę ph lub siły jonowej eluentu.
Wyróżnia się także chromatografię
powinowactwa , w której stosuje się reagujące
swoiście i odwracalnie z cząstkami wirusa
ligandy, oraz chromatografie żelową gdzie
oczyszczanie polega zasadzie różnic w
gęstości molekularnej (sito molekularne)