PCR w czasie
PCR w czasie
rzeczywistym
rzeczywistym
real-time
real-time
PCR
PCR
PCR w czasie
PCR w czasie
rzeczywistym
rzeczywistym
real-time
real-time
PCR
PCR
Real-time PCR
Real-time PCR
bazuje na
bazuje na
konwencjonalnej
konwencjonalnej
metodzie
metodzie
PCR
PCR
Problemy metody PCR:
Problemy metody PCR:
1
1
-brak możliwości określenia
-brak możliwości określenia
początkowej liczby kopii badanego
początkowej liczby kopii badanego
fragmentu DNA, mierząc ilość
fragmentu DNA, mierząc ilość
produktu na końcu reakcji PCR
produktu na końcu reakcji PCR
2
2
-czasochłonny etap detekcji
-czasochłonny etap detekcji
produktu reakcji i jego ilości
produktu reakcji i jego ilości
(
(
w
,
,
czy
Real-time PCR
Real-time PCR
bardzo szybka analiza ilości produktu
bardzo szybka analiza ilości produktu
w każdym cyklu reakcji PCR (stąd
w każdym cyklu reakcji PCR (stąd
często mówi się o
często mówi się o
„rapid-cycle real-time PCR”)
„rapid-cycle real-time PCR”)
pomija uciążliwe etapy obróbki
pomija uciążliwe etapy obróbki
amplifikowanego materiału po reakcji
amplifikowanego materiału po reakcji
pozwala na wgląd w kinetykę reakcji
pozwala na wgląd w kinetykę reakcji
PCR (inna nazwa real-time PCR to
PCR (inna nazwa real-time PCR to
„kinetic PCR”)
„kinetic PCR”)
oszacowania początkowej ilości
oszacowania początkowej ilości
badanego DNA
badanego DNA
„quantitative PCR”
„quantitative PCR”
pozwala do minimum ograniczyć
pozwala do minimum ograniczyć
ryzyko zanieczyszczenia próby
ryzyko zanieczyszczenia próby
Zasady real-time PCR
Zasady real-time PCR
znakowanie
znakowanie
sond
sond
oligonukleotydowych
oligonukleotydowych
lub
lub
amplikonów
amplikonów
cząsteczkami zdolnymi do
cząsteczkami zdolnymi do
(
)
)
muszą zostać wzbudzone
muszą zostać wzbudzone
światłem o określonej długości fali,
światłem o określonej długości fali,
a wyemitowana przez nie energia
a wyemitowana przez nie energia
musi być wykryta i zmierzona
musi być wykryta i zmierzona
Do obliczenia ilości badanych
Do obliczenia ilości badanych
cząsteczek obecnych w mieszaninie
cząsteczek obecnych w mieszaninie
na początku reakcji wykorzystuje się
na początku reakcji wykorzystuje się
moment, w którym poziom
moment, w którym poziom
barwnika przekroczy
barwnika przekroczy
zdefiniowany próg (CT).
zdefiniowany próg (CT).
Poszczególne
Poszczególne
kolorowe linie
kolorowe linie
obrazują różne
obrazują różne
reakcje (próby
reakcje (próby
badane oraz
badane oraz
standardy), gdy
standardy), gdy
poziom
poziom
fluorescencji dla
fluorescencji dla
danej reakcji
danej reakcji
przekroczy próg
przekroczy próg
(30,0 jednostek
(30,0 jednostek
umownych;
umownych;
pozioma linia
pozioma linia
czerwona)
czerwona)
kalkulowana jest
kalkulowana jest
ilość cykli po
ilość cykli po
których to nastąpiło
których to nastąpiło
(CT; pionowe
(CT; pionowe
czerwone linie; nie
czerwone linie; nie
muszą to być liczby
muszą to być liczby
całkowite!).
całkowite!).
lość cykli po
lość cykli po
których kinetyka
których kinetyka
reakcji wchodzi w
reakcji wchodzi w
fazę logarytmiczną
fazę logarytmiczną
(FAM Ct) - poziom
(FAM Ct) - poziom
fluorescencji
fluorescencji
fluorochromu FAM
fluorochromu FAM
przekroczył próg
przekroczył próg
30 jednostek -
30 jednostek -
odnotowana
odnotowana
zostaje dla próbek
zostaje dla próbek
badanych (UNKN,
badanych (UNKN,
ang. unknown)
ang. unknown)
oraz standardów
oraz standardów
(STD, ang.
(STD, ang.
standard).
standard).
Reakcj
Reakcj
a
a
Typ
Typ
FAM
FAM
Std/R
Std/R
es
es
FAM
FAM
Ct
Ct
A1
A1
UNKN
UNKN
0,59
0,59
4
4
28,0
28,0
3
3
A2
A2
UNKN
UNKN
1,90
1,90
1
1
26,2
26,2
A3
A3
UNKN
UNKN
0,81
0,81
27,5
27,5
4
4
A4
A4
UNKN
UNKN
0,66
0,66
6
6
27,8
27,8
5
5
A5
A5
UNKN
UNKN
0,45
0,45
9
9
28,4
28,4
3
3
A6
A6
UNKN
UNKN
0,30
0,30
4
4
29,0
29,0
8
8
A7
A7
UNKN
UNKN
0,49
0,49
6
6
28,3
28,3
1
1
B1
B1
STD
STD
0,53
0,53
6
6
28,1
28,1
9
9
B2
B2
STD
STD
ND
ND
39,0
39,0
4
4
B3
B3
STD
STD
3,25
3,25
25,4
25,4
1
1
B4
B4
STD
STD
1,62
1,62
7
7
26,3
26,3
8
8
B5
B5
STD
STD
0,41
0,41
2
2
28,5
28,5
5
5
B6
B6
STD
STD
0,20
0,20
3
3
29,8
29,8
3
3
B7
B7
STD
STD
0,10
0,10
1
1
30,7
30,7
6
6
B8
B8
STD
STD
0
0
0
0
A8
A8
UNKN
UNKN
0,25
0,25
8
8
29,3
29,3
4
4
Dysponując takimi
Dysponując takimi
danymi komputer
danymi komputer
wykreśla krzywą
wykreśla krzywą
standardową, z
standardową, z
której odczytuje
której odczytuje
wartości ilości kopii
wartości ilości kopii
(FAM Std/Res) dla
(FAM Std/Res) dla
próbek badanych
próbek badanych
(UNKN).
(UNKN).
Barwniki i sondy używane w real-
Barwniki i sondy używane w real-
time PCR
time PCR
1-cząsteczki fluorochromu
1-cząsteczki fluorochromu
emitujące
emitujące
światło o określonej długości po
światło o określonej długości po
związaniu się z dwuniciowym
związaniu się z dwuniciowym
DNA,
DNA,
takie jak
takie jak
jodek
jodek
propidyny
propidyny
,
,
czy
czy
I
I
SYBR-DNA ma maksimum
przypadające na
równą
równą
498nm (
498nm (
kolor niebieski
kolor niebieski
), a maksimum emisji przy
), a maksimum emisji przy
522nm (
522nm (
kolor zielony
kolor zielony
). SYBR bardzo silnie i
). SYBR bardzo silnie i
specyficznie wiążę się do DNA, dając silny sygnał
specyficznie wiążę się do DNA, dając silny sygnał
wprost proporcjonalny do ilości DNA w próbie
wprost proporcjonalny do ilości DNA w próbie
2-Sondy TaqMan
2-Sondy TaqMan
-
-
krótkie
krótkie
oligonukleotydy
oligonukleotydy
zawierające na
zawierające na
końcu 5’ reporter
końcu 5’ reporter
fluorescencji
fluorescencji
(np.
(np.
FAM, NED
FAM, NED
),
),
a na końcu
a na końcu
3’ cząsteczkę
3’ cząsteczkę
wygaszającą
wygaszającą
fluorescencję
fluorescencję
(np.
(np.
TAMRA, DABCYL
TAMRA, DABCYL
).
).
Wielkość sondy umożliwia
Wielkość sondy umożliwia
przekazywanie energii
przekazywanie energii
między fluorochromami.
między fluorochromami.
Sonda taka po związaniu
Sonda taka po związaniu
się z komplementarną
się z komplementarną
sekwencją na etapie
sekwencją na etapie
wydłużania jest
wydłużania jest
degradowana przez
degradowana przez
polimerazę Taq
polimerazę Taq
posiadającą aktywność 5`-
posiadającą aktywność 5`-
egzonukleazową, przez co
egzonukleazową, przez co
fluorochrom ulega
fluorochrom ulega
oddzieleniu od
oddzieleniu od
wygaszacza. Rozdział obu
wygaszacza. Rozdział obu
cząsteczek umożliwia
cząsteczek umożliwia
emisję światła
emisję światła
fluorescencyjnego
fluorescencyjnego
http://www.youtube.com/watch?
http://www.youtube.com/watch?
v=ZfnJXCr4NVA
v=ZfnJXCr4NVA