Cytometr (cytofluorometr) przepływowy służy do
Cytometr (cytofluorometr) przepływowy służy do
szybkiego pomiaru dużej ilości cząstek lub
szybkiego pomiaru dużej ilości cząstek lub
komórek zawieszonych w cieczy i
komórek zawieszonych w cieczy i
przepływających jedna za drugą przez punkt
przepływających jedna za drugą przez punkt
pomiarowy.
pomiarowy.
Zaletą tej metody jest fakt, że pomiar
Zaletą tej metody jest fakt, że pomiar
dokonywany jest na pojedynczej komórce, a nie
dokonywany jest na pojedynczej komórce, a nie
uśredniany na całą populację oraz, że w krótkim
uśredniany na całą populację oraz, że w krótkim
czasie (kilka- kilkadziesiąt sekund) można
czasie (kilka- kilkadziesiąt sekund) można
zanalizować tysiące komórek.
zanalizować tysiące komórek.
Cytometr przepływowy
Cytometr przepływowy
Umożliwia ocenę morfologii komórek
Umożliwia ocenę morfologii komórek
poprzez pomiar rozproszenia światła przez
poprzez pomiar rozproszenia światła przez
komórki.
komórki.
FSC
FSC
– światło rozproszone w osi promienia
– światło rozproszone w osi promienia
świetlnego odpowiadające w przybliżeniu
świetlnego odpowiadające w przybliżeniu
wielkości komórek
wielkości komórek
SSC
SSC
– światło rozproszone pod kątem 90° do
– światło rozproszone pod kątem 90° do
osi padającego promienia wyrażające
osi padającego promienia wyrażające
ziarnistość badanych cząsteczek.
ziarnistość badanych cząsteczek.
Cytometria przepływowa
Cytometria przepływowa
Umożliwia ocenę fluorescencji (FL1, FL2,
Umożliwia ocenę fluorescencji (FL1, FL2,
FL3) barwników zastosowanych do
FL3) barwników zastosowanych do
znakowania komórek (fluorochromów) po
znakowania komórek (fluorochromów) po
wzbudzeniu
wzbudzeniu
przez promień lasera.
przez promień lasera.
Fluorochromy związane są z przeciwciałami
Fluorochromy związane są z przeciwciałami
łączącymi się z antygenami
łączącymi się z antygenami
powierzchniowymi
powierzchniowymi
i wewnątrzkomórkowymi.
i wewnątrzkomórkowymi.
Cytometria przepływowa
Cytometria przepływowa
rozpoznawanie białaczek i chłoniaków oraz monitorowanie
rozpoznawanie białaczek i chłoniaków oraz monitorowanie
przebiegu choroby
przebiegu choroby
diagnostyka wrodzonych i nabytych zaburzeń
diagnostyka wrodzonych i nabytych zaburzeń
immunologicznych
immunologicznych
diagnostyka trombocytopenii, określenie liczby
diagnostyka trombocytopenii, określenie liczby
retikulocytów
retikulocytów
ocena markerów powierzchniowych komórek
ocena markerów powierzchniowych komórek
nowotworowych (komórki złuszczone z powierzchni guzów
nowotworowych (komórki złuszczone z powierzchni guzów
lub materiał z biopsji cienkoigłowej)
lub materiał z biopsji cienkoigłowej)
badania naukowe (ocena fazy cyklu komórkowego,
badania naukowe (ocena fazy cyklu komórkowego,
apoptozy, ilość wydzielanych cytokin i inne)
apoptozy, ilość wydzielanych cytokin i inne)
w przypadku połączenia cytometru z sorterem – sortowanie
w przypadku połączenia cytometru z sorterem – sortowanie
komórek
komórek
Zastosowanie cytometrii
Zastosowanie cytometrii
przepływowej:
przepływowej:
Apoptozę trudno badać w materiale
Apoptozę trudno badać w materiale
tkankowym co wynika z:
tkankowym co wynika z:
krótkiego czasu trwania - od kilku
krótkiego czasu trwania - od kilku
do kilkunastu godzin
do kilkunastu godzin
fagocytozy ciałek apoptotycznych
fagocytozy ciałek apoptotycznych
Wykrywanie procesu apoptozy
Wykrywanie procesu apoptozy
Techniki wykrywania apoptozy opierają się na analizie:
Techniki wykrywania apoptozy opierają się na analizie:
zmian morfologii komórek (
zmian morfologii komórek (
ocena jądra komórkowego, stanu
ocena jądra komórkowego, stanu
kondensacji chromatyny, znakowanie ciałek apoptotycznych
kondensacji chromatyny, znakowanie ciałek apoptotycznych
)
)
przemieszczenia się fosfatydyloseryny (FS) na zewnątrz błony
przemieszczenia się fosfatydyloseryny (FS) na zewnątrz błony
komórkowej (
komórkowej (
test z aneksyną V
test z aneksyną V
)
)
czynności mitochondriów (
czynności mitochondriów (
zmniejszenie akumulacji rodaminy
zmniejszenie akumulacji rodaminy
123 w związku ze spadkiem mitochondrialnego potencjału
123 w związku ze spadkiem mitochondrialnego potencjału
transbłonowego
transbłonowego
)
)
aktywacji kaspaz apoptotycznych (
aktywacji kaspaz apoptotycznych (
kaspaza 3
kaspaza 3
)
)
wypływu cytochromu c i AIF z mitochondriów
wypływu cytochromu c i AIF z mitochondriów
degradacji DNA (
degradacji DNA (
elektroforetyczna ocena długości
elektroforetyczna ocena długości
fragmentów DNA, znakowanie rozszczepionych końców DNA
fragmentów DNA, znakowanie rozszczepionych końców DNA
-TUNEL, cytometryczna ocena zawartości DNA
-TUNEL, cytometryczna ocena zawartości DNA
)
)
Wykrywanie procesu apoptozy
Wykrywanie procesu apoptozy
Document Outline