Podsumowanie ćwiczenia 6
Rola polimeraz SOS w mutagenezie indukowanej HNE i UV
HNE
A
3 polimerazy
B
Pol II
C
Pol IV
D
Pol V
l. Ły-
sinek
%
MF
X10
-4
l.
Ły-
sine
k
%
MF
X10
-4
l.
Ły-
sine
k
%
MF
X10
-4
l.
Ły-
sine
k
%
MF
X10
-4
0
1421
10
0
>2
794
10
0
>2
771
100 2,6
797
1
0
0
31
5
532
37
97
496
62 100
481
62 3,5
429
5
4
130
15
146
10
150
92
11 500
72
9,3 19
0
59
7,
4
140
50
18
1,2 320
22
2,7
92
5
0,6
5
40
0
14
1,
7
180
UV
1 min
197
14
40
5
63
8,2
159
2
0
UV
3 min
33
2,3
32
4
5
0,6
5
50
6,
3
1
10
100
0
50
100
HNE (mM)
S
ur
vi
va
l
[%
]
J M105
uvr
uvr umuDCpolB
uvr dinBumuDC
uvr dinBpolB
DNA polymerase IV is engaged in
DNA polymerase IV is engaged in
translesion synthesis of HNE-DNA
translesion synthesis of HNE-DNA
adducts
adducts
0.0E+00
2.5E-03
5.0E-03
7.5E-03
0
10
20
HNE(mM)
M
u
ta
ti
o
n
f
re
q
en
cy
uvr dinBumuDC
uvr dinBpolB
uvrpolDC
Pol
IV
Pol
II
Pol
V
DNA polymerase IV bypasses HNE-DNA adducts in an error-
DNA polymerase IV bypasses HNE-DNA adducts in an error-
free manner. DNA polymerase V is responsible for mutations.
free manner. DNA polymerase V is responsible for mutations.
Podsumowanie ćwiczenia 7
MutS
dziki
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2
3 4
3 2 4 1 3 2 1 4 1 2 3
4
dzień 0 / dzień 1 /
dzień 3
dzień 0 / dzień 1 / dzień 3
Ćwiczenie 8:
Testy wykrywania mutagenów
środowiskowych
I. Testy bakteryjne (test Amesa, SOS chromotest, test Millera)
wykorzystujące rewersję do prototrofii lub uszkodzenie DNA
II. Inne testy z wykorzystaniem mikroorganizmów, mutageneza w
drożdżach, badanie mutacji ludzkiego genu TP53 w drożdżach
III. Testy z wykorzystaniem Drosophila melanogaster
IV. Mutacje w organizmach ssaków z wykorzystaniem
mikroorganizmów lub wirusów: host-mediated assay
V. Uszkodzenia DNA w komórkach ssaków, test kometkowy
VI. Mutacje punktowe w organizmach ssaków,
big blue mouse
VII. Wymiany chromatyd siostrzanych
VIII. Aberracje chromosomowe
IX. Mikrojądra
X. Testy na kancerogenezę – zaberowane krypty w jelicie grubym
(zmiany przednowotworowe), indukcja nowotworów w różnych
organach)
Funkcjonalny
test na mutacje
w TP53 w
drożdżach
Test bada czy białko
TP53 aktywuje
transkrypcję
drożdżowego genu
reporterowego
ADE2, będącego pod
kontrolą promotora
współpracującego z
TP53. Kolonie
zawierające
wersję
podstawową genu
TP53 są białe
,
natomiast
wersję
zmutowaną są
różowe
.
Test kometkowy
The Big Blue mouse system. The
transgenic mice carrying the lacI target
gene in an integrated -based vector, are
treated with Cr by instillation into the
lung. Later, animals are sacrificed, the
lungs are removed, and lung DNA is
isolated. Target gene sequences are
recovered by packaging and lacI mutants
are identified by plaque color on indicator
plates.
Big blue mouse
1. SOS chromotest
Badamy uszkodzenia DNA indukowane przez
NQO
oraz
DMS
Pierwsza hodowla już została nastawiona przez prowadzących – zaczynamy
od p. 2
Każda grupa robi jeden związek; do DMS kontrolą jest NQO.
2. Wymiana chromatyd siostrzanych
Pokaz preparatów mikroskopowych – oglądamy pod imersją oraz liczymy
liczbę wymian indukowanych 4-hydroksynonenalem w komórkach
nieuszkodzonych oraz z zespołem Wernera (z płyty CD)
3. Zaberowane krypty w jelicie grubym
Oglądamy pod mikroskopem strukturę jelita; szukamy zaberowanych krypt.
Oglądamy preparaty histologiczne przekroju jelita myszy; szukamy
dzielących się i zaberowanych krypt
Ćwiczenie 8
Wymiany chromatyd siostrzanych
Powstają w wyniku rekombinacji homologicznej pomiędzy
siostrzanymi chromatydami w fazie S
Pokaz wymian indukowanych 4-hydroksynonenalem w komórkach z
wyciszoną i niewyciszoną helikazą WRN – każda grupa policzy po 20
metafaz w każdej serii
Zaberowane krypty jelitowe jako zmiany
przednowotworowe
Fig. 2. Multi-stage model of rat colon cancer induced by PhIP. ACF, a candidate preneoplastic
lesion of the colon, are induced shortly after exposure to PhIP. The majority of ACF are
histologically non-dysplastic lesions with a subset of lesions demonstrating dysplastic features.
Approximately one-quarter of dysplastic ACF harbor either Apc or β-catenin mutations. Dysplastic
ACF may further progress into more dysplastic lesions, namely high-grade dysplastic ACF,
adenomas and adenocarcinomas. The susceptibility gene, Sct, on rat chromosome 16 is
considered to control the development of ACF
Różna morfologia zaberowanych krypt
Przekroje podłużne i
poprzeczne przez
ścianę jelita grubego
myszy
(barwione
hematoksyliną i
eozyną)