Wybrane metody w diagnostyce immunologicznej

Niedobory odporności - Jednostki
chorobowe



Zespół hemofagocytarny- pancytopenia

(niedobór

prawidłowych erytrocytów, leukocytów, trombocytów),

przerost

śledziony, fagocytoza szpiku kostnego; immunologia- niska
aktywność komórek NK wysoki poziom sCD25.



SCID - ciężkie złożone niedobory odporności: brak T i B;



SCID-ADA- (niedobór deaminazy adenozyny)- spadek ilości i
proliferacji T, niska aktywność komórek NK



Zespól Di Gorga – delecja, aplazja grasicy – brak limfocytów
T



Zespól Hioba-brak INF-γ, brak chemotaksji neutrofilów,
podwyższone stężenie IgE



CVID- zespół hipogammaglobulinemi IgA, IgM,IgG



Zespół Nijmengen- niedokrwistość, trombocytopenia,
obniżenie stężenia IgE, spadek liczby l.T,l.B, spadek
stosunku CD4/CD8, podwyższenie liczby komórek NK ,
dysgammaglobulinemia

Objawy niedoborów odporności

1. Dwa lub więcej nowych zakażeń ucha w ciągu roku.

2. Dwa lub więcej nowych zakażeń zatok w ciągu roku, przy braku alergii.

3. Jedno zapalenie płuc rocznie w ciągu co najmniej 2 lat.

4. Przewlekła biegunka z utratą masy ciała.

5. Nawracające zakażenia wirusowe (przeziębienia, opryszczka,

brodawki, kłykciny).

6. Konieczność częstego stosowania antybiotyków dożylnych w leczeniu

zakażeń.

7. Nawracające, głębokie ropnie skóry lub narządów wewnętrznych.

8. Uporczywe pleśniawki lub zakażenia grzybicze na skórze lub w innej

lokalizacji.

9. Zakażenie normalnie nieszkodliwymi prątkami niegruźliczymi.

10. Pierwotny niedobór odporności w wywiadzie rodzinnym.

Pierwotne Niedobory Odporności należy podejrzewać, jeżeli wystąpią 2

lub więcej z powyższych objawów ostrzegawczych.

Diagnostyka niedoborów

odporności

Diagnostyka wstępna

badania przesiewowe umożliwiające ocenę każdego elementu układu

immunologicznego

* pełna morfologia krwi obwodowej z oceną obrazu odsetkowego

leukocytów:agranulocytoza, ziarnistości, niedokrwistość

hemolityczna, małopłytkowość, limfopenia

* stężenie immunoglobulin w surowicy krwi –IgG, IgM, IgA, Ig całkowite

> 400 mg/dl, IgG >20mg/dl

* testy nadwrażliwości typu późnego
Trichophyton, Candida,tuberkulina

Diagnostyka specjalistyczna

:•

* Podklasy IgG –IgG2, IgG4-zdolność do syntezy swoistych przeciwciał
* Liczba limfocytów, subpopulacje: B - CD19, CD20, T -CD3, CD4, CD8,

wskaźnik CD4/CD8, ekspresja MHC kl. II (HLA_DR)

* Funkcje limfocytów-proliferacja limfocytów pod wpływem mitogenów:

B - EBV, SAC; T–PHA,OKT-3

* Funkcje granulocytów: test NBT, chemiluminescencja, wytwarzanie

rodników tlenowych, chemotaksja, cząsteczki adhezyjne CD11, CD18

* Ocena składowych dopełniacza, czynników B, P, CH50
* Ocena aktywności enzymów ADA, PNP
* Genetyka

I. Test proliferacji

( Ciężki złożony niedobór odporności - SCID, zespół Di Goerge, zespół

Nezelofa- dysplazja grasicy, Niedobór odporności związany z chromosomem - X )

Ocena odpowiedzi proliferacyjnej limfocytów T i B - określenie zmiany liczby

komórek w hodowli przed i po zadziałaniu czynnika stymulującego

1.Metoda

izotopowa



izolacja komórek jednojądrzastych (MNC) z krwi przez wirowanie w

gradiencie stężeń



hodowla przez 3 dni w 37

C w atmosferze uzupełnianej 5%CO

w obecności

opowiedniego mitogenu



dodanie znakowanej trytem tymidyny (ilość wbudowanego nukleotydu

zależy od intensywności replikacji DNA – częstość podziałów komórkowych)



po 17h inkubacji komórki lizuje się a ich DNA zostaje związane na filtrze



ilość wbudowanego izotopu ocenia się poprzez pomiar w liczniku

scyntylacyjnym



wynik podawany jest jako wartość liczbowa cpm – liczba zliczeń na min

Związki te działają :

poprzez receptory powierzchniowe komórki np. TCR lub CD2 (anty-CD3)

bezpośrednio na wewnątrzkomórkowy szlak aktywacji (PMA)

MITOGEN

limfocyty

limfocyty B

limfocyty T i

PHA

fitohemmaglutyn

ina

Con A

Konkanawalina

Przeciwciała

anty-CD3 (OKT-

SAC

Staphylococcus

aureus szczep

Cowan

Przeciwciała –

anty Ig

PWM

Mitogen

szkarłatki

PMA

Octan

mirystynianu

forbolu

2.Metoda MTT ( MTTS, XTT,WSTs)

Metoda kolorymetryczna oceniająca proliferację komórek

oraz ich żywotność

Metoda oparta jest na redukcji soli tetrazolowych np.: MTT

(bromek 3-(4-5 dimetrylotiazol 2yl)-2,5-difenyloteterazolu)

(żółty

tetrazol

) zostaje zredukowany przez mitochondrialną

reduktazę do czerwonego

formazanu.

- 10

komórek + medium +

MTT

inkubacja 24h, wytrącenie

kryształów formazanu

dodanie detergentu

odczyt ekstyncji w czytniku Elisa

II. Ocena produkcji przeciwciał

in vitro

(

APA-przeciwciała antyfosfolipidowe, zespół Hioba, pospolity zmienny niedobór

odporności CVID, allergie, przemijająca hipogammaglobulinemia niemowląt, zespół

Nijemegen)

1. Metoda ELISA

(enzyme-linked immunosorbent assay)



ocena stężenia immunoglobulin obecnych w surowicy lub

supernatantach hodowlanych



pierwsze przeciwciało skierowane przeciw określonej klasie

immunoglobulin zostaje opłaszczone na powierzchni płytek



po zablokowaniu miejsc niespecyficznego wiązania białka na

płytkę nakłada się badaną surowicę



związane immunoglobuliny wykrywane są za pomocą drugiego

przeciwciała sprzężonego z enzymem np. peroksydazą chrzanową



enzym katalizuje reakcję barwną po dodaniu substratu



zmiana koloru oceniana jest spektrofotometrycznie na czytniku

ELISA

2. Test PFC

(plaque forming cell

assay)

Ocena ilości limfocytów B produkujących przeciwciała



izolacja komórek jednojądrzastych (MNC) z krwi przez wirowanie w

gradiencie

stężeń



inkubacja MNC przez 7 dni w 37

C w atmosferze uzupełnianej 5%CO

mitogenem PWM (indukcja syntezy immunoglobulin)



dodanie do komórek z hodowli 0,8% agarozy z 30% zawiesiną SRBC

opłaszczonych białkami A (białko

S. aureus

wiążące IgG) oraz królicze

przeciwciała przeciw ludzkim immunoglobulinom



wylanie tak przygotowanej zawiesiny na płytki Petriego opłaszczone 1%

agarozą



inkubacja 60 min w temp 37

C, dodanie dopełniacza, inkubacja 60 min

w temp.37



po dodaniu dopełniacza następuje liza opłaszczonych przeciwciałami

krwinek, co

powoduje powstanie charakterystycznych łysinek wokół komórki

produkującej

przeciwciała



1 łysinka=1limfocyt B wynikiem testu jest liczba plaków /500

tys.komórek

III. Test aktywności komórek

(SCID-ADA –głębsza limfopenia, nowotwory, zakażenia wirusowe)



Izolacja komórek jednojądrzastych (MNC) z krwi przez wirowanie w

gradiencie stężeń



przygotowanie komórek linii nowotworowej K

562 ,

inkubacja z DiO (3,3

’

–

diooctadecyloxacarbocyanine perchlorate –

zielony barwnik

fluorescencyjny)



komórki K

562

+ limfocyty +

jodek propidyny

(czerwony

barwnik fluorescencyjny barwiący martwe komórki)



inkubacja 4h

w temp 37

C w atmosferze uzupełnianej 5%CO



odczyt w cytofluorometrze przepływowym



wynikiem analizy jest % poziomu i aktywności komórek NK



ocena odsetka komórek CD16 w krwi obwodowej pacjenta (FACS)

IV. Wybrane testy służące do

oceny mechanizmów

odporności nieswoistej

1. Oznaczenie poziomu dopełniacza

Układ dopełniacza - swoiste białka krążące we krwi będące

mediatorami reakcji zapalnej.Nie wymagają uprzedniej

ekspozycji na antygen.

Niedobory dopełniacza wywołują

Niedobory dopełniacza wywołują wrażliwość na zakażenia

bakteryjne i skłonność do chorób autoimmunizacyjnych

Układ dopełniacza rozpoznaje:

kompleksy

immunologiczne,

kompleksy

polisacharydowe

Aktywacja składników dopełniacza prowadzi do:

zwiększenia przepuszczalności naczyń krwionośnych,

migracji leukocytów do ogniska zapalnego,

stymulacji procesu fagocytozy,

zwiększenia rozpuszczalności kompleksów immunologicznych,

Aktywacja dopełniacza

droga

klasyc

zna

droga

lektyno

droga

alternatyw

MAC (C5-C9) - kompleks

atakujący błonę komórkową

Liza komórki

Najczęściej oznacza się następujące składniki dopełniacza:

C3, C4, inhibitor C1, czynnik B, czynnik P (properdyna).

CH100,CH50-całkowity poziom dopełniacza

Wykorzystuje się metody serologiczne z użyciem swoistych

przeciwciał: immunodyfuzja radialna,

ELISA

, RIA



obniżenie poziomu C3 - choroby autoimmunizacyjne

(toczeń rumieniowaty, kłębuszkowe zapalenie nerek),



niewielki spadek poziomu C3 - schorzenia wątroby

(przewlekłe zapalenie wątroby, marskość poalkoholowa),



wzrost poziomu C3 - ostre i przewlekłe zakażenia



niedobór C3 czynnika H, I- zakażenia paciorkowcami



C4 (wchodzi w skład konwertazy C5) – poziom obniżony w

toczniu rumieniowatym i wrodzonym obrzęku

naczyniowym



wrodzony brak inhibitora C1 - obrzęk naczynioruchowy

(Qyinckego-obrzęk kratani)



nabyty niedobór inhibitora C1- zaburzenia związane z

limfocytami B (przewlekłe białaczki, szpiczak mnogi)



niedobór C5,6,7,8,9,czynnika d,properdyny- zakażenia

dwoinką zapalenia opon mózgowych , Neisseria

Meningitidis)

2. Ocena zdolności granulocytów do

fagocytozy

(wrodzone neutropenie, cylkiczne neutropenie, zespół Chediaka-

Higashiego)

Proces fagocytozy mierzymy wykorzystując zdolność komórek żernych

do pochłaniania cząsteczek, do produkcji wolnych rodników czy

migrację do czynników zapalnych

+ NADPH

oksydaza NADPH

-2

+NADP

-2

+ 2 H

+ dysmutaza ponadtlenkowa

+ O

+ Cl

mieloperoksydaza

HOCL + OH

Fagotest:

(niedobory cząsteczek adhezyjnych)

Test

wykonuje się z użyciem pełnej krwi pacjenta

oraz cząsteczek zymosanu (

Sacharomyces

cereviesie

) sprzężonych z fluorochromem (do

fagotestu można też użyć

bakterii wybarwionych

fluorochromem)

100µ krwi

+ 1mln cząsteczek zymosanu–

Alexa Fluor

inkubacja 1h ( 37

C , 5%CO

)

odczyt w cytofluorometrze przepływowym

Wynikiem analizy jest % komórek które pochłonęły

zymosan

b) Test redukcji cytochromu C - ocena

produkcji wolnych rodników tlenowych

(

przewlekła choroba ziarniniakowa-uszkodzenie

oksydazy NADPH)

Test oparty jest na redukcji cytochromu C przez rodniki

ponadtlenkowe(0

) wytwarzane przez błonowy układ

oksydazy NADPH komórek fagocytujących w czasie

tzw. ”wybuchu tlenowego”

izolacja granulocytów

granulocyty + PMA +

cytochrom C

zmiana zabarwienia cytochromu c pod wpływem

wolnych rodników

odczyt ekstynkcji w czytniku ELISA (550nm)

V. Mieszana hodowla limfocytów

(MLC)



badanie wykonywane przy kwalifikowaniu do przeszczepu

szpiku,

służy potwierdzeniu zgodności w układzie

HLA klasy II

między

potencjalnym biorcą a dawcą



limfocyty mają zablokowaną zdolność do proliferacji

poprzez naświetlanie promieniowaniem jonizującym lub np.

mitomycyną C



w mieszanej hodowli powyższe komórki pełnią rolę czynnika

stymulującego proliferację limfocytów drugiej osoby



odpowiedź proliferacyjną ocenia się testem inkorporacji

znakowanej trytem tymidyny

B - limfocyty biorcy

D - limfocyty dawcy

Bx - limfocyty biorcy naświetlone promieniowaniem jonizującym

Dx - limfocyty dawcy naświetlone promieniowaniem jonizującym

BBx, DDx – autostymulacje

BDx, DBx – mieszane hodowle limfocytów

Wynikiem testu jest wartość indeksu stymulacji:

is BDx = (BDx – BBx)/BBx is DBx = (DBx – DDx)/DDx

is BDx < 1 is DBx < 1 zgodność w układzie HLA

klasy II

is BDx > 1

is DBx < 1

ryzyko odrzucenia

przeszczepu

is BDx < 1

is DBx > 1 ryzyko choroby przeszczep

przeciw gospodarzowi

Test MLR w diagnostyce poronień

nawykowych

AAx

BBx

ABx

BAx

Surowica

spulowana

10 000 cpm

Surowica

pacjentki

5 000 cpm

A-limfocyty pacjentki, Ax – napromieniowane limfocyty pacjentki
B- limfocyty jej partnera, Bx – napromieniowane limfocyty partnera

ABx (w surowicy spulowanej) – 100%
Jaki odsetek stanowi wartość ABx w wariancie z surowicą pacjentki?
Dla wartości z tabeli – 5000/10000 = 50%

Wartości prawidłowe ~40-70% wpływu hamującego surowicy
pacjentki

U chorego występowały nawracające zakażenia bakteryjne. W związku

z tym wykonano in vitro badania immunologiczne oceniające funkcje

komórek układu odpornościowego. Uzyskano następujące wyniki:

proliferacja limfocytów aktywowanych fitochematoglutyniną

(PHA) – 10700 cpm (norma = 17.310-46.152 cpm)

proliferacja limfocytów aktywowanych zawiesiną bakterii

Staphylococcus aureus(Cowan) – 500 cpm (norma = 696 - 4.226 cpm)

synteza przeciwciał(PFC) – obniżona

test redukcji cytochromu C –8,05 nmoli tlenu/250 000

komórek/30 min.

(norma = 6,5-10,1 nmoli tlenu/250 000 komórek/30 min.)

Wyniki te sugerują:

upośledzenie funkcji limfocytów T

upośledzenie funkcji limfocytów B

upośledzenie funkcji limfocytów T i B

upośledzenie funkcji granulocytów

nie występuje upośledzenie funkcji żadnej z badanych populacji

komórek układu odpornościowego

Który z wymienionych testów można wykorzystać do oceny funkcji

komórek fagocytujących (granulocytów):

test redukcji cytochromu C

test PFC (Plaque forming cells)

c) test cytotoksyczny

Który z wymienionych testów można wykorzystać do oceny funkcji

limfocytów B:

a) Proliferacja limfocytów po stymulacji mitogenem PHA, OKT3

b) Proliferacja limfocytów po stymulacji SAC, Elisa, PFC

c) Test PFC, MLR

d) Test redukcji cytochromu c, CH50

Document Outline