Biochemia: Ćw. 12 – Metoda RT-PCR
1
Ć
wiczenie 12
M
ETODA
RT-PCR
Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych:
bromek etydyny
– T+
EDTA
– Xi
etanol, 96%
– F
kwas octowy, 96%
– C
β
-merkaptoetanol
– N, T
Tris
– Xi
U
WAGI WST
Ę
PNE
Praca z kwasami nukleinowymi (np. izolacja, reakcja PCR) wymaga zachowania szczególnej czystości, poniewaŜ kwasy nukleinowe łatwo uleqają degradacji. Dotyczy to głównie
RNA, ze względu na powszechną obecność rybonukleaz (RNaz) – enzymów katalizujących niespecyficzne rozrywanie łańcuchów rybonukleinowych. PoniŜej zamieszczono kilka
uwag istotnych podczas eksperymentów, w których uŜywamy kwasów nukleinowych.
Wszystkie czynności wykonujemy w czystych rękawiczkach, które przemywamy 70% etanolem.
Wszystkie końcówki, probówki i szkło muszą być autoklawowane.
Probówki pobieramy ze zlewki metalową pincetą, przemytą etanolem.
Izolację kwasów nukleinowych oraz przygotowanie reakcji PCR wykonujemy pod laminarem wysterylizowanym lampą UV. Miejsce do izolacji i aparat do rozdziału
elektroforetycznego przemywamy 70% etanolem.
Bufory z zestawu do izolacji, składniki zestawu do reakcji PCR, polimerazy pobieramy tylko końcówkami z filtrem.
PBS sterylizujemy przez filtrowanie (filtr o średnicy porów 0.2
µ
m); bufory z gotowych zestawów do izolacji i reakcji PCR są sterylne.
Metoda RT-PCR (ang. PCR – polymerase chain reaction, RT - reverse transcriptase) słuŜy min. do analizy ekspresji badanego genu. Bezpośrednim i
najbardziej miarodajnym sposobem sprawdzenia, czy gen ulega ekspresji w danej komórce jest wykrycie obecności transkryptu danego genu – cząsteczek
mRNA. Technika RT-PCR składa się z dwóch etapów:
- reakcji odwrotnej transkrypcji, w której mRNA przepisywane jest na cDNA,
- amplifikacji (wielokrotnego powielenia) cząsteczek cDNA metodą klasycznego PCR.
Ostatnim etapem badania ekspresji genu jest elektroforeza produktów (amplifikatów) reakcji PCR wykonywana najczęściej w Ŝelu agarozowym.
1.
I
ZOLACJA
RNA
NA MINIKOLUMNACH Z WYKORZYSTANIEM ZESTAWU FIRMY
Q
IAGEN
Materiał do izolacji kwasów nukleinowych stanowią skrawki tkankowe, całe narządy pobierane od zwierząt, komórki ustalonych linii komórkowych lub linii
pierwotnych hodowane in vitro w naczyniach hodowlanych (szalkach Petriego, płytkach wielodołkowych lub butelkach). Zamieszczona poniŜej procedura w
punktach 1 – 4 odnosi się do komórek adherentnych hodowanych in vitro.
1. Po osiągnięciu 70 – 90% zarośnięcia naczynia hodowlanego (szalki Petriego o średnicy 6 cm) komórki przemyć zimną poŜywką nie
zawierającą surowicy a następnie zimnym sterylnym PBS*.
2. Po dokładnym odciągnięciu roztworu PBS komórki zebrać sterylnym skrobakiem do probówki typu Eppendorf o poj. 1.5 ml w 350
µ
l
buforu lizującego RLT zawierającego
β
-merkaptoetanol. Tak zebrane komórki moŜna przechowywać w temp. -70
°
C przez okres 1
miesiąca.
3. Do ekstraktów komórkowych dodać 350
µ
l 70% etanolu, zamieszać pipetą.
4. 700
µ
l mieszaniny nałoŜyć na minikolumnę do izolacji RNA. Po zwirowaniu (8000 RPM**, 15 s, RT***) kolumnę przełoŜyć do nowej
probówki wirowniczej o poj. 2 ml.
5. Dodać 700
µ
l buforu RW1, zwirować (8000 RPM, 15 s, RT).
6. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i dodać 500
µ
l buforu RPE, zwirować (8000 RPM, 15 s, RT).
7. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i dodać 500
µ
l buforu RPE, zwirować (8000 RPM, 2 min, RT).
8. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i zwirować w celu wysuszenia membrany (15000 RPM, 1 min, RT).
9. Kolumnę przenieść do probówki wirowniczej o poj. 1.5 ml i dodać na membranę 30
µ
l wody wolnej od RNaz, zwirować (8000 RPM,
1 min, RT). Czynność powtórzyć nakładając na kolumnę eluat otrzymany z pierwszego wirowania.
*PBS (ang. Phosphate Buffered Saline) – zbuforowany roztwór soli fizjologicznej
**RPM (ang. Revolutions Per Minute) – liczba obrotów na minutę
***RT (ang. Room Temperature) – temperatura pokojowa
Biochemia: Ćw. 12 – Metoda RT-PCR
2
2.
O
KRE
Ś
LENIE ST
Ęś
ENIA ORAZ CZYSTO
Ś
CI
RNA
METOD
Ą
SPEKTROFOTOMETRYCZN
Ą
Kwasy nukleinowe selektywnie pochłaniają światło ultrafioletowe (UV) wykazując maksimum absorbancji przy długości fali 260 nm.
Zjawisko to znajduje zastosowanie w oznaczaniu stęŜenia kwasów nukleinowych, np. w preparatach kwasów nukleinowych po izolacji.
Ekstrakty kwasów nukleinowych mogą być zanieczyszczone np. białkami lub odczynnikami uŜywanymi do izolacji. W celu określenia
czystości przygotowanego preparatu mierzy się absorbanję równieŜ przy dł. fali 280 nm, stanowiącą maksimum absorbancji dla białek.
Preparat uznaje się za czysty wówczas, kiedy stosunek wartości absorbancji A260/A280 mieści się w zakresie 1.7 – 2.0.
Wykonanie: Przygotować dwie probówki typu Eppendorf o poj. 500
µ
l. Do pierwszej (próby ślepej) dodać 100
µ
l a do drugiej 99
µ
l wody
wolnej od RNaz. Do drugiej dodatkowo 1
µ
l otrzymanego roztworu RNA. Zmierzyć absorbancję przy dł. fali 260 i 280 nm (spektrofotometr
Bio-Rad). Spektrofotometr w oparciu o zadaną wartość współczynnika konwersji (ang. conversion factor, zwykle 1:50
µ
g/ml) oraz
rozcieńczenie przelicza zmierzoną wartość absorbancji na stęŜenie wyraŜone w [
µ
g/ml]. Wyliczona przez spektrofotometr wartość ilorazu
A260/A280 świadczy o czystości preparatu.
3.
O
DWROTNA TRANSKRYPCJA
Cząsteczki kwasu mRNA przed amplifikacją w reakcji PCR naleŜy przepisać na cDNA (ang. complementary DNA) w procesie odwrotnej
transkrypcji z uŜyciem enzymu – odwrotnej transkryptazy (RT – ang. reverse transcriptase).
Wykonanie: W probówce typu Eppendorf o poj. 0.5 ml 1
µ
g RNA rozcieńczyć wodą wolną od RNaz do obj. 5
µ
l. W kolejnej probówce o
poj. 0.5 ml przygotować mieszaninę reakcyjną, składającą się z: buforu 10-krotnie stęŜonego, roztworu czterech
deoksyrybonukleozydotrifosforanów (dNTP), krótkich fragmentów oligodeoksyrybonukleotydowych (dT23), wody wolnej od RNaz oraz
enzymu – odwrotnej transkryptazy. Zamieszczona poniŜej Tabela 1 zawiera skład mieszaniny reakcyjnej na jedną próbkę.
Tab.1 Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji odwrotnej transkrypcji.
składniki mieszaniny
objętość [
µ
l]
1.
bufor
10x stęŜony
2
2.
5 mM dNTP
2
3.
70
µ
M Oligo dT23
0,3
4.
woda wolna od RNaz
9,7
5.
odwrotna transkryptaza
1
6.
objętość całkowita
15
Równocześnie z próbką badaną przygotować kontrolę negatywną: mieszanina reakcyjna z wodą wolną od RNaz w miejsce RNA.
Odwrotną transkryptazę dodać na końcu, tuŜ przed dodaniem mieszaniny do probówki zawierającej RNA. Po zwirowaniu, probówki
umieścić w bloku grzejnym i prowadzić reakcję zgodnie ze schematem podanym w Tabeli 2.
Tab.2. Etapy odwrotnej transkrypcji.
nazwa cyklu
temperatura
czas [min]
1.
wstępna denaturacja
65ºC
5
2.
odwrotna transkrypcja
37ºC
60
3.
przerwanie reakcji
95ºC
5
4.
koniec reakcji
4ºC
Biochemia: Ćw. 12 – Metoda RT-PCR
3
4.
A
MPLIFIKACJA C
DNA
METOD
Ą
PCR
Technika PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy lub reakcja łańcuchowa polimeryzacji) zapewnia uzyskanie w przeciągu krótkiego czasu
milionów – miliardów kopii badanego fragmentu DNA. Miejsce syntezy w cząsteczce cDNA wskazują startery – krótkie sekwencje
nukleotydowe komplementarne do początku i końca powielanego odcinka cDNA. Proces syntezy katalizowany jest przez termostabilny
enzym – polimerazę Taq.
Wykonanie: Do probówki o poj. 0.2 ml dodać 2
µ
l (300 ng) cDNA. Przygotować mieszaninę odczynników do reakcji PCR – jeden wspólny
dla wszystkich próbek danego startera. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzi: bufor (10-krotnie stęŜony), Q-solution, roztwór czterech
deoksyrybonukleozydotrifosforanów (dNTP), MgCl
2
(jony magnezu są kofaktorami polimerazy Taq), para starterów (R – ang. reverse i F –
ang. forward), woda wolna od RNaz oraz termostabilna polimeraza Taq. Zamieszczona poniŜej Tabela 3 zawiera skład mieszaniny na
jedną próbkę.
Tab.3. Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji PCR
składniki mieszaniny
objętość [
µ
l]
1.
bufor
10x stęŜony
2.5
2.
Q-solution
5
3.
10 mM dNTP
1.6
4.
MgCl
2
1
5.
20
µ
M starterów R
1
6.
20
µ
M starterów F
1
7.
woda wolna od RNaz
7.65
8.
polimeraza Taq
0.25
objętość całkowita
20
Równocześnie z próbką badaną przygotować kontrolę negatywną (mieszanina reakcyjna z wodą wolną od RNaz w miejsce cDNA).
Polimerazę Taq dodać na końcu, tuŜ przed dodaniem mieszaniny do probówki zawierającej cDNA. Po krótkim zwirowaniu probówki
umieścić w termocyklerze PCR i prowadzić reakcję zgodnie ze schematem podanym w Tabeli 4.
Tab.4. Etapy reakcji PCR.
nazwa cyklu
temperatura
czas [min]
1.
wstępna denaturacja
94ºC
3
2.
denaturacja
94ºC
1
3.
hybrydyzacja
temp. zaleŜy od starterów
1
4.
wydłuŜanie
72ºC
2
30 - 35 cykli (pkty: 2 – 4)
5.
końcowe wydłuŜanie
72ºC
10
6.
koniec reakcji
4ºC
Biochemia: Ćw. 12 – Metoda RT-PCR
4
5.
E
LEKTROFOREZA AGAROZOWA PRODUKTÓW REAKCJI
PCR
Produkt reakcji PCR identyfikujemy rozdzielając uzyskany materiał w Ŝelu agarozowym metodą elektroforezy. Równocześnie z badanym
genem rozdzielmy w Ŝelu standardy masowe – fragmenty DNA o znanych masach cząsteczkowych wyraŜonych w ilości par zasad (pz,
ang. bp). Na podstawie połoŜenia badanego genu w stosunku do standardów masowych określamy jego wielkość.
Wykonanie
Przygotowanie 1% Ŝelu agarozowego
Do kolby stoŜkowej o poj. 250 ml dodać 0.4 g agarozy oraz 40 ml buforu TAE. Dokładnie rozpuszczać agarozę ogrzewając w mikrofalówce
przez 3 – 5 min. Energicznie mieszać zawartość kolby co 1 min, w miarę moŜliwości nie dopuszczając do wrzenia. ZłoŜyć podstawę na Ŝel
z płytkami zamykającymi oraz grzebieniem do formowania studzienek. Do roztworu agarozy schłodzonego pod wodą bieŜącą do temp. 50
– 60ºC dodać 2.5 µl bromku etydyny (uwaga! bromek etydyny ma działanie karcynogenne!). Dokładnie wymieszać a następnie wylać Ŝel
na podstawę i odczekać do zastygnięcia 30 – 40 min. Wyjąć płytki zamykające podstawę z Ŝelem oraz grzebień. Wlać do aparatu ok. 300
ml buforu TAE (40mM Tris-kwas octowy, pH 8.3, 1mM EDTA).
Przygotowanie próbek
Do sterylnej probówki typu Eppendorf o poj. 0.5 ml uŜywając sterylnych końcówek dodać:
4 µl wody dejonizowanej,
1 µl 6x buforu do próbek (Loading Dye Solution, Fermentas),
1 µl DNA (amplifikatu uzyskanego w reakcji PCR).
Wymieszać i krótko zwirować a następnie nakładać do studzienek w Ŝelu agarozowym.
Rozdział elektroforetyczny
Rozdział prowadzić przez 30 – 40 min przy napięciu 80V. Wynik rozdziału elektroforetycznego
analizować w transiluminatorze w świetle
UV.
Na zajęciach obowiązuje strój ochronny: chałat, rękawiczki jednorazowe oraz okulary ochronne.
Zalecana literatura:
"Biochemia" J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, PWN; W-wa 2005, podrozdział pt. "Wybrane sekwencje DNA moŜna wielokrotnie
powielać stosując reakcję łańcuchową polimeryzacji" w rozdziale pt. "Poznawanie genów", str. 149-151 (lub odpowiedni rozdział we
wcześniejszych/późniejszych wydaniach).