Kinetyka reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez
inwertazę
Prowadzący:
dr hab. inż. Ilona WANDZIK
mgr inż. Sebastian BUDNIOK
mgr inż. Marta GREC
mgr inż. Jadwiga PASZKOWSKA
Miejsce ćwiczenia: sala 7
Kinetyka reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez
inwertazę
Prowadzący:
dr hab. inż. Ilona WANDZIK
mgr inż. Sebastian BUDNIOK
mgr inż. Marta GREC
mgr inż. Jadwiga PASZKOWSKA
Miejsce ćwiczenia: sala 7
2
CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest wyznaczenie stałej Michaelisa (K
m
) oraz szybkości
maksymalnej (V
max
) dla reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę
oraz określenie wpływu stężenia enzymu na szybkość hydrolizy sacharozy.
WSTĘP TEORETYCZNY
Kinetyka reakcji enzymatycznych
(na podstawie „Ćwiczenia z biochemii”, praca zbiorowa pod redakcją Leokadii Kłyszejko-
Stefanowicz, PWN, Warszawa-Poznań 1982)
Kinetyka reakcji chemicznych zajmuje się badaniem szybkości przebiegu reakcji w
zależności od różnych czynników (stężenia reagentów, temperatury, obecności
katalizatorów). Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie
zależności pomiędzy szybkością reakcji a czasem jej trwania, co pozwala na podanie
szybkości reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu substratu.
Podstawą
katalitycznej
reakcji
enzymatycznej
jest
odwracalne
wzajemne
oddziaływanie substratu (S) z enzymem (E), przy którym powstaje nietrwały kompleks
(ES), który następnie rozpada się na enzym i produkt reakcji (P).
Schemat reakcji enzymatycznej można przedstawić równaniem:
Gdzie: E
wolny enzym
S
substrat
ES
kompleks enzym-substrat
P
produkt
k
1
, k
2
, k
3
stałe szybkości reakcji
W równaniu tym zakłada się nieodwracalny mechanizm reakcji.
Przy małym stężeniu enzymu, lecz przy zmieniającym się w szerokich granicach
początkowym stężeniu substratu, zmiany początkowej szybkości reakcji, wyrażone jako
ilość substratu przetworzonego w jednostce czasu, można przedstawić w postaci krzywej:
Wpływ zwiększania stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej
E + S
k
1
k
2
ES
E + P
k
3
szybko
ść
V=-d[S]/dt
st
ęż
enie substratu [S]
-d[S]/dt=k[E]
-d[S]/dt=k[E][S]
3
Krzywa w pewnym punkcie zgina się i osiąga wartość maksymalną. Przy małym stężeniu
substratu reakcja jest I rzędu i szybkość reakcji jest uzależniona od stężenia substratu [S].
Przy zwiększeniu stężenia substratu osiąga się maksymalną szybkość reakcji, która jest
niezależna od stężenia substratu. Tłumaczy się to faktem, że przy zbyt małym stężeniu
substratu niektóre cząsteczki enzymu nie są połączone z substratem w danym momencie i
niecałkowite wysycenie enzymu jest przyczyną tego, że nie wykazuje on maksymalnej
aktywności katalitycznej.
W miarę zwiększania stężenia substratu dochodzi do momentu, gdy wszystkie cząsteczki
enzymu są z nim połączone i wówczas enzym pracuje z maksymalną szybkością. Dalsze
zwiększanie stężenia substratu nie wpływa już na zwiększenie szybkości reakcji- reakcja
przebiega ze stałą szybkością.
Dla reakcji (1) szybkość poszczególnych przemian jest następująca:
v
1
=k
1
[E][S]=k
1
[E
c
-ES][S]
(2)
v
2
=k
2
[ES]
(3)
v
3
=k
3
[ES]
(4)
gdzie: [E] – stężenie enzymu wolnego
[S] – stężenie substratu
[ES] – stężenie kompleksu enzym-substrat
[E
c
] – stężenie całkowite enzymu biorącego udział w reakcji
Kompleks ES tworzy się z szybkością v
1
, a rozkłada z szybkością v
2
+v
3
k
1
[E
c
-ES][S]=k
2
[ES]+k
3
[ES]
(5)
Po przekształceniu otrzymujemy:
Uwzględniając, że [E
c
-ES]=[E], otrzymujemy:
Wielkość K
m
zwana stałą Michaelisa jest wyrazem powinowactwa enzymu do substratu.
Enzymy o niskiej wartości K
m
działają znacznie sprawniej niż enzymy o wysokiej K
m
.
Szybkość tworzenia produktu v
3
zależy od [ES], a więc im wartość [ES] jest większa, a
tym samym stała Michaelisa mniejsza, tym szybsze powstawanie produktu.
Szybkość reakcji enzymatycznej można zapisać równaniem
v
3
= v
1
-v
2
(8)
Reakcja v
2
przebiega bardzo wolno, więc można przyjąć, że szybkość procesu
enzymatycznego v przebiega z szybkością v
3
:
v = v
3
= k
3
[ES]
(9)
Gdy substrat występuje w dużym nadmiarze, cały enzym jest nasycony substratem,
[ES]=[E
c
], szybkość reakcji osiąga swą wartość maksymalną:
V
max
= k
3
[E
c
]
(10)
Korzystając z odpowiednich przekształceń równań otrzymujemy zależność:
[Ec-ES][S]
[ES]
=
k2+k3
k1
Km
=
(6)
[E][S]
[ES]
Km
=
(7)
Vmax[S]
Km+[S]
= V (11)
4
Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Menten
Jeżeli do równania (11) wstawimy v=v
max
/2, to otrzymamy po przekształceniu:
K
m
= [S]
(12)
Czyli stała Michaelisa odpowiada takiemu stężeniu substratu, przy którym szybkość
reakcji wynosi połowę szybkości maksymalnej.
Praktyczną metodą określania stałej Michaelisa i szybkości reakcji jest metoda graficzna.
Doprowadzając równanie (11) do postaci:
Otrzymujemy rónanie o postaci ogólnej y = ax + b, gdzie: b = 1/V
max
Równanie (13) nosi nazwę równania Lineweavera-Burka. Przekształcenie to ma na celu
uzyskanie równania o ogólnej postaci linii prostej. W układzie współrzędnych wartości 1/v
odkłada się na osi rzędnych, a wartości 1/[S] na osi odciętych. Równanie daje wówczas
linię prostą, której nachylenie określa stosunek K
m
/V
max
. Przecina ona oś rzędnych w
punkcie 1/V
max
, a oś odciętych w punkcie 1/K
m
. W ten sposób można określić maksymalną
szybkość V
max
oraz stałą Michaelisa K
m
.
Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Menten według Lineweavera-Burka
[S]
szybko
ść
reakcji
V
Vmax
1/2 V
Km
1
Km 1
Vmax [S]
+
1
Vmax
=
V
(13)
5
Aktywność optyczna
Związki optycznie czynne posiadają zdolność skręcania płaszczyzny polaryzacji światła.
Gdy światło spolaryzowane, wykazujące drgania w określonej płaszczyźnie przejdzie
przez substancję optycznie czynną, wówczas jego drgania pojawiają się w innej
płaszczyźnie. Kierunek i stopień skręcenia można mierzyć za pomocą polarymetru.
Skręcenie w lewo oznaczamy znakiem (-), a skręcenie w prawo znakiem (+). Na przykład
(+)-sacharoza jest prawoskrętna. Wielkość kąta skręcenia zależy od liczby cząsteczek
znajdujących się na drodze wiązki światła podczas jej przechodzenia przez rurkę
polarymetryczną, a zatem zależy od stężenia próbki i od długości rurki pomiarowej.
Skręcalność właściwą [
αααα
]
D
danego związku definiujemy jako zaobserwowaną wartość
skręcenia, gdy długość rurki pomiarowej wynosi 1 decymetr, stężenie próbki wynosi
1g/ml, a długość fali światła wynosi 589 nm.
[
α
]
D
=
c
l
α
α
- obserwowane skręcenie (w stopniach),
l – długość rurki polarymetrycznej (w dm),
c – stężenie roztworu (g/ml).
Skręcalność właściwa [
α
]
D
jest wielkością fizyczną charakterystyczną dla danego
związku optycznie czynnego, podobnie jak temperatura topnienia, temperatura wrzenia,
gęstość lub współczynnik załamania światła.
Hydroliza sacharozy
Sacharoza jest dwucukrem zbudowanym z cząsteczki D-glukopiranozy i D-
fruktofuranozy. Wiązanie łączące glukozę z fruktozą ulega hydrolizie i to zarówno pod
wpływem kwasów mineralnych, jak i enzymu zwanego inwertazą. Z tą reakcją związane
jest zjawisko zwane
inwersją sacharozy
, polegające na zmianie znaku skręcalności
roztworu sacharozy (+), gdyż w powstałej równomolowej mieszaninie cukrów fruktoza
silniej skręca płaszczyznę polaryzacji w kierunku (-) niż glukoza (+) i cały roztwór
przyjmuje skręcalność ujemną, czyli po reakcji znak skręcalności roztworu zmienia się na
przeciwny (inwersja). Otrzymywany produkt, który jest mieszaniną D-glukozy i D-
fruktozy nazywany jest cukrem inwertowanym.
C
12
H
22
O
11
+
H
2
O
C
6
H
12
O
6
+
C
6
H
12
O
6
sacharoza
D-glukoza
D-fruktoza
[
α
]
D
= +66.4o
[
α
]
D
= +52.1o [
α
]
D
= -93.1o
cukier inwertowany
[
α
]
D
= -20.5o
6
WYKONANIE ĆWICZENIA
Sprzęt:
polarymetr,
rurka polarymetryczna,
kolba miarowa o poj. 100 ml, 6 szt,
pipeta miarowa o poj. 25 ml,
kolby stożkowe o poj. 50 ml, 6 szt.,
mikropipeta, ,
waga analityczna.
Materiał i odczynniki:
sacharoza,
bufor octanowy o pH 4,7
roztwór inwertazy
Zadanie 1. Wyznaczanie stałej Michaelisa dla reakcji hydrolizy
sacharozy katalizowanej przez inwertazę.
Wykonanie ćwiczenia:
Przygotować 100 ml roztworu sacharozy o stężeniu 4 g/100 ml w buforze octanowym.
Do 25 ml roztworu dodać 0.100 ml (100
µ
l) roztworu inwertazy, wymieszać, szybko
napełnić rurkę polarymetryczną i zmierzyć kąt skręcania. Pomiary wykonać w 2, 4, 6,
8 i 10 minucie od wprowadzenia inwertazy do roztworu.
Analogicznie przeprowadzić hydrolizę sacharozy wobec takiej samej ilości enzymu
dla roztworów o stężeniu 0,5 g/100 ml, 1 g/100 ml, 1,5 g/100 ml, 2 g/100 ml i 3 g/100
ml.
Opracowanie wyników:
1.
Uzyskane wyniki zebrać w tabeli (dla każdego stężenia substratu):
Czas,
min
Skręcalność,
stopnie
Stężenie
substratu, c
s
g/100 ml
Stężenie
produktu, c
o
-c
s
,
g/100 ml
Szybkość
początkowa, v
o
,
g/min
1/c
O
1/v
O
2
4
6
8
10
O
S
c
l
c
*
23
,
0
*
16
,
1
+
=
α
l- długość rurki polarymetrycznej, dm
α
- kąt skręcania, stopnie
c
O
- stężenie wagowe sacharozy na początku pomiarów, g/100 ml.
7
2.
Dla każdego stężenia sacharozy wykreślić zależność ilości wytworzonego
produktu (c
O
– c
S
) od czasu.
3.
Na każdym wykresie przeprowadzić styczną do krzywej w punkcie t = 0 i
wyznaczyć szybkość początkową reakcji równą tg
α
.
4.
Sporządzić wykres Michaelisa-Menten na podstawie wyznaczonych szybkości
początkowych v
O
oraz wyznaczyć na tej podstawie stałą Michaelisa K
m
.
5.
Sporządzić wykres zależności 1/v
O
od 1/c
O
dla równania Lineweavera-Burka i
wyznaczyć stałą Michaelisa K
m
oraz maksymalną szybkość reakcji V
max
.
Zadanie 2. Wpływ stężenia enzymu na szybkość hydrolizy sacharozy.
Wykonanie ćwiczenia:
Przygotować 100 ml roztworu sacharozy o stężeniu 10 g/100 ml w buforze
octanowym i do 25 ml tego roztworu wprowadzić 0.25 ml roztworu inwertazy.
Wymieszać, szybko napełnić roztworem rurkę polarymetryczną i zmierzyć kąt
skręcenia. Pomiary powtórzyć w 5, 10, 15 i 20 minucie doświadczenia.
Analogicznie przeprowadzić badania stosując: 0.125 ml, 0.050 ml, 0.025 ml roztworu
inwertazy.
Opracowanie wyników:
1.
Uzyskane wyniki zebrać w tabeli – dla każdego stężenia inwertazy:
Czas,
min
Skręcalność,
stopnie
Stężenie
substratu, c
s
g/100 ml
Stężenie
produktu, c
o
-c
s
,
g/100 ml
Szybkość
początkowa, v
o
,
g/min
0
5
10
15
20
2.
Dla każdego stężenia enzymu sporządzić wykresy zależności ilości produktu od
czasu.
3.
Wyznaczyć szybkości początkowe reakcji.
4.
Przedstawić graficznie zależność szybkości v
O
od stężenia enzymu.
5.
Zinterpretować uzyskane wyniki.
Warunki zaliczenia ćwiczenia:
•
Pozytywny wynik kartkówki dopuszczającej do wykonania ćwiczenia
•
Wykonanie sprawozdania,
Uwaga: na zajęcia należy przynieść papier milimetrowy