Izolacja DNA

Obecnie wykorzystywane metody
izolacji:



Zastosowanie mieszaniny fenol:chloroform



Wysalanie białek



Wiązanie DNA do nośnika

Wybór odpowiedniej metody
zależy od:



Rodzaju materiału genetycznego jaki chcemy uzyskać
(DNA genomowe, mitochondrialne, plazmidowe,
RNA, itp.)



Pochodzenia (roślinne, zwierzęce, bakteryjne,
wirusowe, itp.)



Rodzaju materiału z jakiego przeprowadzamy izolację
(z tkanek, organu, hodowli komórkowej)



Oczekiwanych rezultatów (czystość, jakość, czas
izolacji)



Przeznaczenia (PCR, klonowanie)

Porównanie metod

Fenol: chloroform

wysalanie

nośnik

zalety

Otrzymane DNA jest
wysokiej czystości

Nie narusza
struktury białek, jest
odwracalne

Prostota, szybkość,
wydajność

wady

Konieczne jest
utrzymanie
odpowiedniego pH

Powolność procesu

Niższa wydajność
niż w przypadku
izolacji
fenol:chloroform

Etapy izolacji DNA

Przygotowanie materiału biologicznego



Oczyszczenie (z zewnętrznych zanieczyszczeń,
pożywki i pozostałości innych komórek)



Homogenizacja



Zawieszenie w buforze

Etapy izolacji DNA

2. Dezintegracja i liza komórek oraz uwolnienie DNA do

roztworu oraz zabezpieczenie DNA przez degradacją.



Rozbicie ściany i błony komórkowej



Uwolnienie DNA i innych komponentów
wewnątrzkomórkowych do roztworu



Inaktywacja enzymów nukleolitycznych

Etapy izolacji DNA

3. Oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych

komponentów komórkowych



Dysocjacja kompleksów DNA-białko



Oddzielenie DNA od innych rozpuszczalnych
komponentów komórkowych

Etapy izolacji DNA

4. Zagęszczenie preparatu DNA i usunięcie

zanieczyszczeń małocząsteczkowych



Uzyskanie roztworu DNA o pożądanej czystości i
gęstości

Izolacja DNA metodą fenolową

liza komórek i oddzielenie białek od DNA- dodanie
krwi do fenolu

Fenol denaturuje białka

Nie denaturuje całkowicie RNaz

Jest rozpuszczalnikiem dla RNA



Dodanie fenolu, wytrząsanie, wirowanie

Izolacja DNA metodą fenolową

2. Dalsze oczyszczanie z białek

Mieszanina fenol/chloroform/ alkohol izoamylowy
25/24/1

Chloroform ułatwia rozdzielenie fazy wodnej i
organicznej

Inaktywacja i usunięcie enzymów

Izolacja DNA metodą fenolową

3. Usuwanie fenolu

Resztki fenolu usuwa się poprzez dodanie samego
chloroformu do zebranej fazy wodnej

4. Wytrącanie DNA

Dodanie izopropanolu do fazy wodnej

Po wirowaniu DNA jest w osadzie na dnie probówki.

Izolacja DNA metodą fenolową

5. Przemycie DNA

Dodanie etanolu 70%

Wirowanie

Pozostawienie do wyschnięcia

6. Rozpuszczenie osadu DNA

Dodanie roztworu o niskiej sile jonowej- woda lub
bufor TE

Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych



Krew jest lizowana o odpowiednim buforze lizującym,
który zawiera sole chaotropowe i detergenty niejonowe



Dodatkowo wykorzystuje się Proteinazę K (silna
proteaza) – liza komórek i degradacja wszystkich
białek.

Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych



Następnie mieszanina nakładana jest na kolumnę ze
złożem krzemionkowym – DNA osiada na złożu,
zanieczyszczenia przechodzą przez nie

Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych



W tej metodzie izolacji wykorzystuje się wiązanie
DNA do złoża krzemionkowego w wysokim stężeniu
soli chaotropowych. Ujemnie naładowane cząsteczki
DNA łączą się w dużym stężeniu soli do dodatnio
naładowanej krzemionki. Zanieczyszczenia są
odpłukiwane, a następnie DNA wymywany jest
roztworem o niskim stężeniu soli (woda lub bufor w
niskim stężeniu)