1
Mikrobiologia wody
W wodach lądowych znaleźć można przedstawicieli prawie wszystkich grup
drobnoustrojów. Oprócz form typowo wodnych występują drobnoustroje bytujące normalnie
w glebie, powietrzu, przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt oraz inne. Liczba, jakość i
rozwój drobnoustrojów w wodzie zależy od warunków przyrodniczych, klimatycznych,
meteorologicznych, rodzaju dna, pory roku, pory doby oraz charakteru, jakości i głębokości
wody. Drobnoustroje występujące w wodzie można podzielić na dwie grupy:
1. Drobnoustroje autochtoniczne, czyli tubylcze, dla których woda jest naturalnym
ś
rodowiskiem bytowania i rozwoju.
2. Drobnoustroje allochtoniczne, czyli naniesione, do których zalicza się:
• drobnoustroje pochodzące z powietrza i gleby;
• drobnoustroje przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt przedostające się do wody wraz z
odchodami bezpośrednio lub za pośrednictwem ścieków komunalnych;
Ze względu na ich znaczenie dla zdrowia i gospodarki człowieka mikroorganizmy
występujące w wodzie można podzielić następująco:
a) saprofityczne, nieszkodliwe dla ludzi i zwierząt; zalicza się do tej grupy autotrofy i
heterotrofy wspomniane wyżej,
b) patogenne, czyli chorobotwórcze,
c) szkodliwe w określonych gałęziach przemysłu.
Bakterie patogenne należą do drobnoustrojów allochtonicznych i dostają się do wody
z przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt. W wodzie nie rozmnażają się, lecz są przenoszone
na następnego żywiciela. Drogą wodną przenoszona jest cholera wywoływana przez
przecinkowca
cholery
(Vibrio
cholerae).
Bakterie
te
przeżywają
w
wodach
powierzchniowych do kilku tygodni, a w wodzie wodociągowej kilka dni.
Dur brzuszny wywoływany jest przez pałeczkę duru brzusznego (Salmonella typhi),
czerwonka przez pałeczki czerwonki (Shigella flexneri i S. sonni), tularemia wywoływana jest
przez Pasteurella tularensis.
Drogą wodną może być przenoszona również brucelloza (Brucella abortus), żółtaczka
zakaźna (Leptospira icterohaemorrhagiae), gorączka błotna (Leptospira grippotyphosa).
Ponadto woda przenosi wirusy, np: wirus Polio.
Wykrycie drobnoustrojów patogennych pochodzenia jelitowego jest pracochłonne i
trudne m.in. ze względu na wymagania żywieniowe patogenów oraz ich małą ilość w
porównaniu z innymi drobnoustrojami. Dlatego wykrywanie zanieczyszczeń kałowych w
wodzie prowadzi się pośrednio przez badanie obecności innych bakterii występujących w
dużych ilościach w przewodzie pokarmowym, łatwych w hodowli i przeważnie
nieszkodliwych w stosunku do ludzi. Bakterie te należą do grupy pałeczek okrężnicy, z
których najważniejsze gatunki to Escherichia coli i Enterobacter aerogenes. Stwierdzenie
zawartości bakterii z grupy coli powyżej normy świadczy o fekalnym zanieczyszczeniu wody,
a tym samym o możliwości występowania bakterii chorobotwórczych. Ilościowo obecność
bakterii z grupy coli określa się tzw. mianem coli.
Miano coli jest to najmniejsza ilość badanej próby w ml lub w g, w której stwierdza
się jeszcze obecność pałeczki z grupy coli. Miano coli wyrażane jest liczbą niemianowaną.
Gdy miano coli wynosi np. 10, znaczy to, że w 10 cm
3
lub 10 g znajduje się co najmniej jedna
komórka z grupy pałeczki okrężnicy. Gdy miano coli wynosi 0,1 (10
-1
), oznacza to, że jedna
komórka z grupy okrężnicy znajduje się w 0,1 cm
3
, czyli 10 komórek w l cm
3
. Wartość miana
coli jest więc odwrotnie proporcjonalna do stopnia zakażenia wody.
2
Obecnie zamiast używać terminu miano coli podaje się objętość w której nie powinny
być obecne bakterie z grupy coli, np. nieobecne w 100 cm
3
, nieobecne w 10 cm3, 1 cm
3
, 0,1
cm
3
itp. Oczywiście im większa objętość w której nie stwierdza się bakterii z grupy coli tym
czystsza jest próbka wody.
Wymogi w stosunku do wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi określa:
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 29 marca 2007 r. w sprawie jakości wody
przeznaczonej do spożycia przez ludzi, które zostało zaktualizowane poprzez
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 20 kwietnia 2010 r. zmieniające
rozporządzenie w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi
.
Wartości poszczególnych parametrów, które muszą być spełnione podano w załącznikach do
powyższych rozporządzeń.
Woda produkcyjna stosowana w zakładach przemysłu spożywczego powinna
odpowiadać pod względem stanu sanitarnego wodzie pitnej. Jakość mikrobiologiczna wody
ma szczególne znaczenie tam, gdzie woda jest jednym z głównych surowców (np. w
winiarstwie, piwo warstwie). Zakażenia wniesione z wodą mogą poważnie zakłócić
prawidłowość procesów fermentacyjnych. Również woda używana do mycia urządzeń,
opakowań i przewodów nie powinna zakażać powierzchni, z którymi się styka. Dlatego stan
sanitarny wody ma bardzo duże znaczenie w technologii żywności.
Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów w wodzie wodociągowej
Przed pobraniem próbek wody z kranu wodociągowego lub rury wylotowej należy
końcówkę wylewki przemyć tamponem nasączonym 70% alkoholem lub w miarę możliwości
opalić palnikiem. Następnie odkręcić kran na 10 minut aby spłynęły pierwsze partie wody po
czym pobrać próby podstawiając wyjałowione naczynie. Naczynia napełnia się wodą
maksymalnie do połowy objętości po czym zamyka korkiem (np. z waty). Na naczyniu należy
umieścić podpis miejsca i czasu poboru oraz nazwisko pobierającego.
Analizę mikrobiologiczną należy wykonać jak najszybciej po pobraniu próby (do 2
godzin). Jeśli nie jest to możliwe, to próbki wód czystych przechowuje się w temperaturze 1-
10°C do 12 godzin, a próbki wód zanieczyszczonych - do 6 godzin. Przechowywanie próbek
nawet w chłodni powoduje zmiany w składzie ilościowym i jakościowym mikroflory m.in. ze
względu na różne tempo rozmnażania drobnoustrojów w warunkach chłodni oraz ze względu
na działalność bakteriofagów.
Wykonanie oznaczenia:
Ogólną liczbę drobnoustrojów w wodzie oznacza się metodą płytkową na pożywce agarowej.
Próbki wody przed posianiem na płytki należy odpowiednio rozcieńczyć, zależnie od
spodziewanego zakażenia. Najbardziej czytelne są płytki, na których liczba koloni mieści się
w granicach 30-300. Płytki do posiewu należy opisać, podając imię i nazwisko wykonującego
oznaczenie, rodzaj wody, rozcieńczenie, rodzaj podłoża i datę posiewu. Wodę wodociągową
posiewa się bezpośrednio (1 cm
3
) i po rozcieńczeniu w stosunku 1:10 (10
-1
). Wszystkie
posiewy wykonuje się w dwóch powtórzeniach (na 2 równoległe płytki). Po posiewie płytki
zalewa się upłynnioną i ochłodzoną do 45-50
°
C pożywką agarową, miesza ruchem kolistym
po powierzchni stołu z posianą próbką po czym pozostawia do skrzepnięcia.
Zestalone płytki z agarem odżywczym inkubuje się odwrócone do góry dnem przez
24 godziny w temperaturze 37°C i przez 72 godziny w temperaturze 20°C. Po inkubacji
oblicza się kolonie wyrosłe na płytkach i ocenia jakość wody.
3
Wykrywanie obecności bakterii z grupy coli
W skład bakterii z grupy coli wchodzą rodzaje Escherichia, Enterobacter, Klebsiella,
Citrobacter. W oznaczeniu wykorzystuje się cechy fizjologiczne tych bakterii.
Bakterie z grupy coli są nie przetrwalnikującymi, względnymi beztlenowcami o optymalnej
temperaturze wzrostu 37°C. Fermentują cukry, w tym laktozę, z wytworzeniem kwasów i
gazów. Tryptofan redukują do indolu.
Do wykrywania bakterii z grupy coli wykorzystuje się podłoża wybiórcze, tj. takie, które
hamują wzrost innych drobnoustrojów mogących zniekształcić wynik. Dodaje się w tym celu
do podłoża barwniki, takie jak zieleń brylantowa, fiolet goryczkowy i tryptoflawina,
hamujące wzrost bakterii gramdodatnich. Stosowany bywa również dodatek żółci wołowej
jako składnika selektywnego. Składnikiem różnicującym jest laktoza, fermentowana tylko
przez nieliczne drobnoustroje.
Podłoże przygotowuje się w probówkach zawierających wewnątrz małe, odwrócone do góry
dnem probóweczki, tzw. rurki Durhama. Podczas wyjaławiania rurki Durhama napełniają się
podłożem.
Wodę wodociągową, której miano powinno być większe niż 50, posiewa się systemem 5x10
cm
3
. Wykonuje się to w ten sposób, że do 5 probówek lub buteleczek zawierających po 10
cm
3
podwójnie stężonego podłoża wprowadza się po 10 cm
3
wody wodociągowej.
Zaszczepione próby umieszcza się w termostacie o temperaturze 37°C i inkubuje przez 48
godzin. Obecność gazu w rurce Durhama w ilości nie mniejszej niż 1/10 objętości oraz
jednoczesna zmiana barwy podłoża pod wpływem wytworzonych kwasów (obniżenie pH) z
czerwonej (czerwień obojętna) na żółtą lub z fioletowej (purpura bromokrezolowa) na żółtą
wskazują na obecność bakterii z grupy coli.
Wyniki odczytać na podstawie poniższej tabeli.
Posiane objętości próbki w cm
3
10
10
10
10
10
Miano coli
–
–
–
–
–
powyżej 50
+
–
–
–
–
50
+
+
–
–
–
25
+
+
+
–
–
17
+
+
+
+
–
12,5
+
+
+
+
+
10
4
Mikroflora powietrza
Powietrze nie jest środowiskiem sprzyjającym rozwojowi drobnoustrojów, jakkolwiek
mikroflora stale jest w nim obecna, przedostając się do powietrza z gleby, powierzchni roślin
i od zwierząt. Na ogół przyjmuje się, że drobnoustroje nie rozmnażają się w powietrzu, lecz
są tylko przenoszone prądami powietrznymi z miejsca na miejsce. Jednak według niektórych
autorów drobnoustroje mogą odżywiać się substancjami organicznymi rozpuszczonymi w
kropelkach mgły wodnej zawieszonej w powietrzu i rozmnażać się.
Skład ilościowy i jakościowy mikroflory powietrza zależy od wielu czynników. Nad miastami
znajduje się więcej mikroflory niż nad lasami i polami. Nad glebami uprawnymi powietrze
zawiera więcej drobnoustrojów niż nad pustyniami. Najmniej zakażone jest powietrze nad
górami, morzami, oceanami i lasami. Powietrze przed deszczem zawiera więcej komórek
drobnoustrojów niż po deszczu.
Zawartość drobnoustrojów w powietrzu zmienia się wraz z wysokością. Na ulicach
miasta znajduje się kilka do kilkuset tysięcy komórek drobnoustrojów w l litrze powietrza. Na
wysokości 500 m nad miastem stwierdzono już tylko 2-3 komórki w litrze, a na wysokości
2000 m powietrze zawierało średnio 0,5 komórki w litrze.
Duży wpływ na stopień zakażenia powietrza drobnoustrojami ma pora roku. Najwięcej
drobnoustrojów stwierdza się w miesiącach: czerwiec-sierpień, najmniej w miesiącach
grudzień-styczeń. W miesiącach zimowych mikroflora jest uwięziona w lodzie, zamarzniętej
glebie i przykryta jest śniegiem, w związku z czym mniej przedostaje się jej do powietrza.
Liczba drobnoustrojów w pomieszczeniach, szczególnie o dużym zagęszczeniu ludzi i
sprzętów, jest wielokrotnie większa niż w powietrzu w miejscach odkrytych. W
pomieszczeniach znajduje się szczególnie dużo drobnoustrojów chorobotwórczych
wydzielanych przez ludzi ze śliną, przy kichaniu i kaszlu. W zakładach przemysłowych
stopień zakażenia powietrza zależy od stanu sanitarnego pomieszczeń produkcyjnych,
sprzętów, kanałów, higieny osobistej personelu oraz od stanu mikrobiologicznego surowców,
półproduktów i produktów.
Wielu badaczy stwierdzało w powietrzu do 100 różnych gatunków drobnoustrojów, w
przeważającej większości saprofitycznych. Drobnoustroje chorobotwórcze spotyka się
głównie tylko w otoczeniu człowieka. Z bakterii najczęściej spotyka się Micrococcus i
Sarcina, które na podłożach hodowlanych rosną w postaci barwnych (żółtych, białych,
pomarańczowych)
kolonii,
pałeczki
z
rodzaju
Achromobacter
oraz
tlenowce
przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus. Zwykle w powietrzu spotyka się zarodniki grzybów i
drożdże. Z drożdży najczęściej występują rodzaje Rhodotorula i Torulopsis, a z pleśni
rodzaje: Penicillium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Cladosporium i Demiatum.
Zdolność do przetrwania mikroorganizmów w powietrzu zależy od ich wrażliwości na
wysuszenie. Mycobacterium tuberculosis (prątek gruźlicy), Bacillus anthracis (laseczka
wąglika), Pseudomonas aeruginosa - syn. Pseudomonas pyocyanea (pałeczka ropy błękitnej),
a także liczne gronkowce są odporne na wysuszenie i giną w powietrzu powoli. Odwrotnie
natomiast Neisseria meningitidis (dwoinka zapalenia opon mózgowych), Vibrio comma
(przecinkowiec cholery) czy Yersinia pestis (pałeczka dżumy) - giną w podobnych warunkach
stosunkowo szybko.
Powietrze
ma
zdolność
samooczyszczania.
Podstawowym
mechanizmem
samooczyszczania powietrza jest osiadanie zawiesiny bakteryjnej pod wpływem sił
grawitacyjnych. Szybkość osiadania zawiesiny zależy od wielkości komórek drobnoustrojów
lub ich aglomeratów. Dlatego mieszanie i zawartość wilgoci w powietrzu jest ważnym
czynnikiem w samooczyszczaniu. W powietrzu będącym w ruchu istnieje większe
prawdopodobieństwo zderzenia się komórek bakteryjnych, łączenia z kropelkami pary
wodnej i tworzenia dużych aglomeratów, co ułatwia ich osiadanie.
5
Innym czynnikiem wpływającym na naturalne oczyszczanie powietrza jest
promieniowanie ultrafioletowe. Skuteczność działania promieniowania ultrafioletowego na
drobnoustroje jest odwrotnie proporcjonalna do zapylenia powietrza, dlatego m.in. powietrze
nad lasami czy na dużych wysokościach zawiera mniej drobnoustrojów niż w zapylonych
ośrodkach miejskich.
Powietrze w przemyśle fermentacyjnym i spożywczym jest z jednej strony naturalnym
ś
rodowiskiem niezbędnym do życia, a z drugiej strony jest czynnikiem zakażającym przez
bezpośrednie stykanie się z surowcem, półproduktem czy produktem, jak np. w czasie
studzenia brzeczki na aparatach ociekowych. W tych przypadkach czystość mikrobiologiczna
powietrza ma szczególne znaczenie. Powietrze w pewnych procesach, takich jak np.
produkcja drożdży lub produkcja antybiotyków w warunkach tlenowych jest w pewnym
sensie surowcem, który, podobnie jak inne surowce, musi podlegać wyjałowieniu przed
wprowadzeniem do fermentora.
Jałowe powietrze potrzebne w procesach fermentacyjnych otrzymuje się, stosując
specjalne metody wyjaławiania. Omówione zostaną najważniejsze z nich.
1. Ogrzewanie powietrza przez sprężanie go do wysokich ciśnień.
2. Działanie promieniami ultrafioletowymi, ultradźwiękami, wysokoenergetycznym
promieniowaniem katodowym i promieniowaniem gamma. Promienie ultrafioletowe mają
zastosowanie przy wyjaławianiu powietrza w salach operacyjnych, w pomieszczeniach, gdzie
produkuje się szczepionki i w komorach jałowych, tzw. boksach lub szafkach Hansena.
3. Odpylanie elektrostatyczne.
4. Rozpylanie substancji bakteriobójczych (fenol, tlenek etylenu, sole metali ciężkich). Ten
sposób może okazać się nieprzydatny, gdy rozpylone substancje będą działały szkodliwie w
procesie, w którym wyjałowione powietrze ma być wykorzystane.
5. Filtracja mechaniczna, czyli zastosowanie filtrów włóknistych. Jest to sposób stosowany
najczęściej. Dawniej używano tylko włókien bawełnianych. Obecnie częściej stosuje się
włókna szklane jako powodujące mniejszy spadek ciśnienia powietrza oraz odporniejsze na
zawilgocenie lub spalanie. W Japonii stosuje się filtry wypełnione włóknami szklanymi o
ś
rednicy 19 µm, a w USA używane są włókna o średnicy około 5 µm. Ponieważ powietrze
tłoczone przez filtry jest uprzednio sprężane, ten system wyjaławiania jest połączeniem
wyjaławiania cieplnego i filtracji mechanicznej. Poza filtracją przez włókna szklane lub
łącznie z nią stosuje się filtrację powietrza przez roztwory kwasów i ługów.
6. Rozpylanie wody lub użycie pary po zakończeniu pracy w pomieszczeniach fabrycznych.
Oznaczanie stopnia zakażenia powietrza
Najważniejszym i najtrudniejszym momentem przy oznaczaniu mikroflory powietrza jest
pobieranie próbek. W tym zakresie wykonano najwięcej prac. Głównie wyróżnia się dwie
grupy metod pobierania prób:
1. osiadanie zawiesin drobnoustrojów,
2. filtracja powietrza przez filtry.
Ad. 1. Osiadanie zawiesin drobnoustrojów. W tej grupie metod wyróżnia się:
- osiadanie drobnoustrojów pod wpływem naturalnych sił grawitacji (metoda sedymentacyjna
Kocha i jej modyfikacje),
- wymuszone osiadanie drobnoustrojów na powierzchni podłoża hodowlanego przez nadanie
powietrzu energii kinetycznej (np. aparat Korotowa),
- osadzanie zawiesin drobnoustrojów siłami elektrostatycznymi,
- osadzanie zawiesin drobnoustrojów parą lub rozpyloną cieczą (np. przyrząd
Reczmienskiego).
6
Ad. 2. Filtracja powietrza przez filtry. W tej grupie metod wyróżnia się sposoby zależnie
od rodzaju użytego filtru:
- filtracja powietrza przez filtry stałe nierozpuszczalne,
- filtracja powietrza przez filtry stałe rozpuszczalne,
- filtracja powietrza przez ciecze w odpowiednich przyrządach.
Jak łatwo zauważyć, metody wyjaławiania powietrza i metody oznaczania mikroflory
powietrza mają wiele wspólnych cech.
Najstarszą i jednocześnie najprostszą metodą badania stopnia zakażenia powietrza jest
metoda sedymentacyjna Kocha, oparta na spontanicznym osiadaniu pyłków i kropelek
niosących mikroorganizmy pod wpływem sił grawitacji. Omeliański stwierdził, że w czasie 5
minut na płytce o powierzchni 100 cm
2
osiada tyle drobnoustrojów, ile znajduje się w 10 dm
3
powietrza. Ta zależność jest wykorzystywana do ilościowych oznaczeń mikroflory w
powietrzu.
Metoda Kocha ma kilka wad, m.in. to, że na płytce osiadają nie tylko drobnoustroje
znajdujące się w powietrzu nad płytką, ale również drobnoustroje z warstw sąsiednich
naniesione prądami powietrznymi. Na płytkach osiadają przede wszystkim drobnoustroje
skupione w większych aglomeratach, a tylko niewielki procent komórek bardzo
rozproszonych. Przy użyciu metody filtracji aparatem Korotowa stwierdzono, że wyniki
uzyskane metodą Kocha są trzykrotnie zaniżone. Pomimo tych niedokładności przy
zapewnieniu stałych parametrów pomiaru, takich jak wielkość płytek, czas pomiaru, metoda
Kocha pozwala uzyskać w prosty sposób w miarę dokładne i porównywalne wyniki.
Oznaczanie stopnia skażenia powietrza metodą sedymentacyjną Kocha.
W celu pobrania prób powietrza z danego miejsca należy przygotować dwie płytki z
agarem odżywczym. Na wieczku płytek napisać imię i nazwisko wykonującego oznaczenie,
datę, rodzaj podłoża i miejsce pobrania próby. Po wylaniu i zastygnięciu płytek zawinąć je w
papier jałowy i przenieść na miejsce pobrania próby. W czasie pobierania próby powietrze
powinno być spokojne, dlatego należy unikać przeciągów, a po przyjściu na miejsce należy
powoli wyjąć płytki z papieru i odczekać aż uspokoi się ruch powietrza spowodowany
przejściem badającego. Położyć płytki na jałowym papierze w pozycji poziomej, zdjąć
wieczko płytki i położyć obok na jałowym papierze wierzchem do góry i zależnie od
przewidywanego zakażenia powietrza eksponować płytki 5, 10 lub 15 minut. Płytki zamknąć
wieczkami, zawinąć w papier i przenieść do termostatu, ustawiając je dnem do góry. Płytki z
agarem odżywczym inkubuje się 48 godzin w temperaturze 37°C. Po inkubacji liczy się
kolonie wyrosłe na płytkach, zakładając, że z każdej komórki wyrosła jedna kolonia i oblicza
się liczbę drobnoustrojów (x) w 10 dm
3
powietrza według następującego wzoru:
c
b
a
x
⋅
⋅
=
100
gdzie:
a - średnia arytmetyczna z liczby kolonii wyrosłych na dwóch płytkach z tym
samym podłożem,
b - powierzchnia płytki [cm
2
],
c - współczynnik czasu ekspozycji płytki; dla 5 minut - c = l, dla 10 minut -
c = 2 i dla 15 minut - c = 3, 100 - przeliczenie powierzchni płytki na 100 cm
2
.
Powietrze uznaje się za bardzo czyste, jeśli liczba drobnoustrojów w 10 dm
3
nie jest większa
od 10 j..t.k., natomiast gdy przekracza 100 j.t.k. - powietrze jest za bardzo zanieczyszczone.
7
Zanieczyszczenie powietrza w pomieszczeniach przeznaczonych do wykonywania analiz
mikrobiologicznych nie powinno być większe niż 2 j.t.k. w 10 litrach.
Wymagania mikrobiologiczne dla powietrza
Pomieszczenia produkcyjne
przemysłu
Sale wykładowe i sale ćwiczeń
Liczba bakterii tlenowych
≤
500-600jtk/m
3
≤
2000jtk/m
3
Liczba grzybów
0-50jtk/m
3
≤
2000jtk/m
3
Mikroflora opakowań
Stopień zakażenia opakowań, szczególnie bezpośrednich, ma duży wpływ na jakość
produktów. Zakażone opakowania wnoszą do produktu mikroflorę, której część, znajdując
tam odpowiednie warunki rozwoju, może spowodować zepsucia. W celu usunięcia
zanieczyszczeń opakowania poddawane są myciu, które oprócz zanieczyszczeń
mechanicznych usuwa również zanieczyszczenia mikrobiologiczne. Przy pakowaniu
aseptycznym odbywa się ścisła dezynfekcja opakowań. Efekt mycia określa się, porównując
stopień zakażenia opakowania przed myciem (A) z zakażeniem po myciu (B), Przyjmując, że
zakażenie przed zabiegiem mycia wynosi 100%, a po zabiegu:
[%]
100
A
B
x
⋅
=
efekt dezynfekcyjny wynosi:
[ ]
%
100
x
y
−
=
Dobrze wykonane mycie usuwa z powierzchni opakowania 99,9% drobnoustrojów.
Metody określania mikroflory opakowań
Mikroflorę opakowań można określić czterema sposobami:
1. metodą popłuczyn,
2. metodą bezpośrednią,
3. metodą tamponową,
4. metodą odciskową.
Wszystkie te metody zaliczane są do hodowlanych metod liczenia drobnoustrojów i różnią się
między sobą sposobem pobierania próby.
METODA POPŁUCZYN. Stosuje sieją do oznaczania mikroflory małych opakowań
szklanych lub metalowych, takich jak butelki, słoje, puszki, konwie itp. Do naczynia wlewa
się płyn Ringera rozcieńczony w stosunku 1:4, w ilości 1/20 objętości naczynia, np. 50 cm
3
płynu Ringera na litrową butelkę. Naczynie zamyka się korkiem lub wieczkiem i wytrząsa 25
razy wzdłuż osi poprzecznej i 25 razy wzdłuż osi podłużnej.
Z popłuczyn robi się posiewy bezpośrednio lub po rozcieńczeniach, zależnie od
przewidywanego zakażenia. Zwykle z opakowań mytych popłuczyny rozcieńcza się do 10
-2
, a
z opakowań nie mytych - do 10
-4
. Zgodnie z zasadami hodowlanych metod liczenia posiewa
się 2-3 równoległe płytki z trzech ostatnich rozcieńczeń. Rodzaj użytego podłoża zależy od
przeznaczenia opakowania. Do opakowań na produkty owocowe stosuje się agar brzeczkowy.
8
Do opakowań konserw warzywnych i warzywno-mięsnych używa się agaru odżywczego z
glukozą, do opakowań produktów mięsnych i ryb - agar odżywczy, a do produktów
mleczarskich - agar bulionowy z mlekiem i laktozą. Płytki z zestalonym podłożem inkubuje
się w warunkach optymalnych dla mikroflory przeważającej w danym produkcie. Płytki z
agarem odżywczym inkubuje się w temperaturze 37°C przez 48 godzin, płytki z agarem
brzeczkowym - w temperaturze 28-30°C przez 72 godziny. Po inkubacji liczy się kolonie i
oblicza stopień zakażenia powierzchni, podając liczbę komórek na l cm
2
powierzchni.
METODA BEZPOŚREDNIA (Richtera). Polega ona na hodowli drobnoustrojów na badanej
powierzchni. Metodę tę stosuje się do oznaczania stopnia zakażenia butelek do mleka. Do
butelki wlewa się około 15 cm
3
rozpuszczonego i zestudzonego do temperatury 45 °C
podłoża bulionowego z mlekiem i laktozą z dodatkiem 3% agaru. Butelkę obraca się tak, żeby
podłoże rozprowadzić po całej powierzchni wewnętrznej butelki. Jeśli butelka jest za ciepła,
można ją schłodzić pod strumieniem wody, a gdy jest za zimna, należy ją ogrzać do
temperatury około 20°C. Butelkę z zestalonym podłożem i uwięzionymi w niej
drobnoustrojami inkubuje się 4 dni w temperaturze 20°C, a następnie liczy się kolonie. Jeśli
kolonii jest niewiele, to liczy się wszystkie, a jeżeli jest ich dużo, to liczy się na 30
kwadracikach o powierzchni l cm
2
i przelicza na całą powierzchnię butelki. Metodę tę ze
zrozumiałych względów można stosować tylko do naczyń niewielkich i przezroczystych.
METODA TAMPONOWA. Stosuje się ją do badania zakażeń dużych powierzchni opakowań
i przedmiotów, takich jak beczki, kadzie fermentacyjne, skrzynki, kontenery, stoły i
urządzenia produkcyjne. Tampony przygotowuje się z czterokrotnie złożonej gazy pociętej na
kwadraty o boku 5 cm. Brzegi pociętej gazy zbiera się razem, zszywa, umieszcza w kolbie
Erlenmayera i wyjaławia w suszarce przez 2 godziny w temperaturze 160°C. Dodatkowym
przyrządem jest szablon wykonany z drutu lub z blachy w postaci kwadratu o znanej
powierzchni, zwykle 25 lub 100 cm
2
. Przed oznaczeniem tampon wkłada się do kolbki
zawierającej jałowy płyn Ringera. Jeśli szablon ma powierzchnię 25 cm
2
, to tampon wrzuca
się do 25 cm
3
płynu. Szablon wyjaławia się w alkoholu, opala w płomieniu i przykłada do
badanej powierzchni; tampon chwyta się jałową pincetą, odciska nadmiar płynu o
wewnętrzną ściankę naczynia i wyciera dokładnie powierzchnię ograniczoną szablonem.
Tampon wrzuca się z powrotem do kolbki z płynem, wytrząsa przez 2 minuty i z otrzymanej
zawiesiny robi się posiew na 2-3 płytki z trzech ostatnich rozcieńczeń. Podłoże hodowlane
dobiera się tak, jak podano w metodzie popłuczyn. Po inkubacji liczy się kolonie i oblicza
zakażenia w przeliczeniu na l cm
2
powierzchni opakowania.
METODA ODCISKOWA. Stosowana jest do oznaczania zakażeń opakowań typu papieru,
pergaminu, folii, korków itp. Zależnie od rodzaju i przeznaczenia opakowania, stosuje się
odpowiednie podłoże. Po wylaniu na płytki podłoża i po zestaleniu agaru, płytki wstawia się
do termostatu o temperaturze 55°C na l godzinę w celu podsuszenia podłoża. Z badanego
opakowania wycina się jałowo kwadraty o boku 5 cm
2
i jałową pincetą przenosi na płytki,
lekko przyciskając do podłoża. Po zdjęciu próbki płytkę inkubuje się w warunkach
optymalnych dla spodziewanej mikroflory. Wyniki oblicza się z trzech równoległych płytek i
podaje jako liczbę komórek na 100 cm
2
powierzchni.
Interpretacja wyników
W prawidłowo umytych opakowaniach nie powinno być więcej niż 10 komórek na l cm
2
.
9
Wymagania czystości mikrobiologicznej opakowań
Pojemność
opakowania
Liczba bakterii
tlenowych
Obecność pałeczek
grupy coli
Stopień czystości
1 litr
poniżej 1000
nb.
dobry
1 litr
poniżej 1500
nb.
dostateczny
0,5 litra
poniżej 500
nb.
dobry
0,5 litra
poniżej 750
nb.
dostateczny
0,25 litra
poniżej 200
nb.
dobry
0,25 litra
poniżej 500
nb.
dostateczny
Ocena czystości mikrobiologicznej sprzętu do produkcji, naczyń oraz sztućców
Do wymazu przygotować:
−
butelkę mikrobiologiczną małą z jałowym tamponem z waty
−
butelkę mikrobiologiczną małą z 20 cm
3
wyjałowionego rozcieńczlnika –
wody peptonowej
−
pincetę
Wykonanie oznaczenia
−
pęsetę zanurzyć w 70% roztworze etanolu i ostrożnie opalić nad palnikiem gazowym,
−
za pomocą pęsety chwycić tampon i w sposób jałowy zanurzyć w butelce z wodą
peptonową, odcisnąć nadmiar cieczy o wewnętrzną ściankę naczynia i wytrzeć
dokładnie powierzchnię badanego sprzętu, w wypadku talerzy, kubków i szklanek
wytrzeć również górną krawędź, w przypadku sztućców uwzględnić też części wygięte i
przestrzenie międzyzębowe widelców.
Następnie przenieść tampon z powrotem do
butelki z wodą peptonową,
−
za pomocą pęsety ponownie dokładnie zwilżyć tampon w wodzie peptonowej,
−
butelkę z tamponem wytrząsać 5 minut,
−
wykonać posiew popłuczyn z butelki na obecność:
−
Ogólnej liczby bakterii tlenowych mezofilnych – posiew wgłębny, na płytki
petriego w sposób jałowy wylać po 1 cm
3
i 0,1 cm
3
(1 cm
3
rozc. 10
-1
) w
dwóch powtórzeniach, zalać pożywką PCA (OLD), inkubować 30 °C/72 godz.
−
Liczbę bakterii z grupy coli – posiew wgłębny, na płytki petriego w sposób
jałowy wylać po 1 cm
3
w dwóch powtórzeniach, zalać pożywką VRBL,
inkubować 30 °C/48 godz.
Zgodnie z wymogami sanitarnymi naczynia uważa się za czyste, jeżeli liczba bakterii
tlenowych na całej powierzchni przedmiotu nie przekracza 100, a pałeczki grupy coli są
nieobecne w 1 cm
3
popłuczyn.
Badanie skuteczności mycia i dezynfekcji rąk pracowników
Do wymazu przygotować:
−
butelkę mikrobiologiczną z czterema jałowymi tamponami z waty
−
butelkę z 40 cm
3
wyjałowionego rozcieńczlnika – wody peptonowej
−
jałową pincetę
10
Wykonanie oznaczenia
−
pincetę zanurzyć w 70% roztworze etanolu i ostrożnie opalić nad palnikiem gazowym,
−
za pomocą pincety chwycić tampon i w sposób jałowy zanurzyć w butelce z wodą
peptonową, odcisnąć nadmiar cieczy o wewnętrzną ściankę naczynia i wytrzeć
dokładnie wewnętrzną powierzchnię dłoni, przestrzenie pomiędzy palcami oraz
powierzchnię paznokci. przenieść tampon do butelki z wodą peptonową,
−
pobrać kolejny suchy jałowy tampon pincetą i wytrzeć nim ponownie rękę z której
uprzednio pobierano wymaz za pomocą zwilżonego tamponu.
−
po dokonaniu wymazu suchy tampon umieścić w tej samej butelce z wodą peptonową
do której przeniesiono tampon z pierwszego wymazu na mokro
−
czynności pobierania wymazów powtórzyć za pomocą kolejnych wyjałowionych
tamponów dla drugiej ręki.
−
butelkę z tamponami wytrząsać 5 minut
−
wykonać posiew popłuczyn z butelki na obecność:
−
Ogólnej liczby bakterii tlenowych mezofilnych – posiew wgłębny, na płytki
petriego w sposób jałowy wylać po 1 cm
3
i 0,1 cm
3
(1 cm
3
rozc. 10
-1
) w
dwóch powtórzeniach, zalać pożywką PCA (OLD), inkubować 30 °C/72 godz.
−
Liczbę bakterii z grupy coli – posiew wgłębny, na płytki petriego w sposób
jałowy wylać po 1 cm
3
i 0,1 cm
3
(1 cm
3
rozc. 10
-1
) w dwóch powtórzeniach,
zalać pożywką VRBL , inkubować 30 °C/48 godz.
Interpretacja wyników czystości rąk pracowników
Liczba bakterii
tlenowych mezofilnych
Obecność gronkowców
koagulazododatnich
Obecność rodziny
Enterobacteriaceae lub
pałeczek gr. coli
Stopień czystości rąk
≤
100
n.b.
n.b.
ręce czyste
100-1000
n.b.
n.b.
ręce dostatecznie czyste
1000<
n.b.
n.b.
ręce brudne
Badanie czystości mikrobiologicznej jednorazowych ręczników papierowych do rąk
metodą odciskową
Na 2 płytki petriego wylać w sposób jałowy pożywkę na ogólną liczbę drobnoustrojów
(PCA). Po zestaleniu agaru płytki odwrócić do góry dnem i uchylone pozostawić pod komorą
laminarną około 1 godziny w celu przeschnięcia agaru.
Materiał przeznaczony do badań umieścić na przemytym 70% etanolem i wyjałowionym
ś
wiatłem UV blacie pod komorą laminarną. Następnie wyjałowionymi nad palnikiem
nożyczkami wyciąć w badanym materiale kwadrat o boku 5x5 cm, po czym za pomocą
wyjałowinej w etanolu i nad palnikiem pincety odcisnąć go na uprzednio przygotowanej
płytce z pożywką. Podczas odciskania można posłużyć się wyjałowioną w etanolu i nad
palnikiem głaszczką. Czynności wycinania materiału i odciskania powtórzyć na drugiej
płytce.
Odciśnięte płytki inkubować w temp. 30 st. C przez 72 godziny.
11
Badanie czystości mikrobiologicznej odzieży roboczej pracowników oraz powierzchni za
pomocą jednorazowych płytek odciskowych Dipsilde (Oxoid) oraz płytek Biocorp
według instrukcji prowadzącego zajęcia i producentów płytek
Opracowano na podstawie:
Duszkiewicz-Reinhard W., Grzybowski R., Sobczak E.: Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii
ogólnej i technicznej. Wyd. SGGW Warszawa, 2003.