Laboratorium  Fizjologii  

WYZNACZANIE  PUNKTU  KOAGULACJI  BIAŁEK  

SPOWODOWANYCH  OBECNOŚCIĄ  SOLI

 

3  

 

 

 

1. 

CEL DOŚWIADCZENIA  

Zapoznanie  się  z  metodą  wyznaczania  punktu  koagulacji  białek  opartej  na  pomiarze  zmętnienia 
roztworów  metodą turbidymetryczną w roztworach soli o różnym przewodnictwie. 
 
2. 

TEORIA  

„Wysalaniem  białek  nazywamy  proces  wytrącenia  z  roztworu  białek  rozpuszczalnych  w  wodzie  przez 
wysokie stężenie soli. Stosuje się  w tym celu sole, których jony łatwo tworzą  wodziany. Zjawisku wysalania 
sprzyjają   te  aniony,  które  tworzą   wiązania  wodorowe  lub  mają   dużą   elektroujemność.  Elektrolity 
wielowartościowe  działają  silniej  od  jednowartościowych.  Sole  wiążące  wodę  pozbawiają  białka  płaszcza 
wodnego,  sprzyjając  ich  asocjacji  w  większe  agregaty  o  zmniejszonej  rozpuszczalności,  które  wypadają  z 
roztworu.  Stężenie  soli  potrzebne  do  wysalania  białek  zależy  od  ich  właściwości  oraz  pH  środowiska. 
Najłatwiej wysolić  białko w jego punkcie izoelektrycznym, ponieważ  cząsteczki na zewnątrz obojętne łatwo 
asocjują  w  większe  agregaty  wypadające  z  roztworu.  Do  wysalania  najczęściej  stosuje  się  (NH

4

)

2

SO

4

, 

Na

2

SO

4

, MgSO

4

. Wysalanie białek jest procesem odwracalnym, usunięcie soli, np. przez dializę, sprawia, że 

wytrącone  białko  ponownie  rozpuszcza  się  i  wykazuje  swe  biologiczne  właściwości.  Wysalanie  stosuje  się  
do wstępnego frakcjonowania białek, również  osocza. Z osocza wytrąca się  fibrynogen przy 25% nasyceniu 
siarczanem  amonu,  większość   globulin  osocza  wytrąca  się   przy  50%  nasyceniu  siarczanem  amonu, 
natomiast albuminy i dobrze rozpuszczalne globuliny wysalane są  dopiero przy 80% nasyceniu siarczanem 
amonu.”[1] 

 
3. 

MATERIAŁY, ODCZYNNIKI, URZĄDZENIA: 

Spektrofotometr 
2 kuwety polistyrenowe 
0,5% r-r żelatyny 

 

Siarczan amonu 
Kolba miarowa 100 ml 
Woda destylowana 
Waga 
12 falkonów 
Pipeta Pasteura 
Pipeta 100-1000 µl 
Pipeta szklana 25 ml 
Gruszka do pipety 
Końcówki do pipety (niebieskie) 
Konduktometr 
Elektroda konduktometryczna 
 

 

Laboratorium  Fizjologii  

WYZNACZANIE  PUNKTU  KOAGULACJI  BIAŁEK  

SPOWODOWANYCH  OBECNOŚCIĄ  SOLI

 

3  

 

4. 

PRZEBIEG DOŚWIADCZENIA 

a)  Włączanie spektrofotometru: 

Włączyć spektrofotometr przełącznikiem znajdującym się z boku obudowy. Następnie 
odczekać co najmniej 15 minut na rozgrzanie się lampy. W tym czasie przygotować roztwory 
do pomiarów zgodnie z punktami b-d. 

UWAGA! Podczas inicjalizacji spektrofotometru nie podnosić pokrywy komory pomiarowej! 
Jeśli spektrofotometr jest włączony należy się upewnić czy był włączony, przez co najmniej 
15min.  
 

b)  Na wadze elektronicznej do pustej kolby miarowej odważyć 32 (±2%) g  siarczanu amonu i 

dopełnić wodą do kreski. Wynik zapisać. Roztwór wymieszać. Obliczyć stężenie siarczanu 
amonu w otrzymanym roztworze. 

Należy najpierw dodać taką objętość wody by łatwo rozpuścić większość soli a dopiero później 
dodać resztę wody. 
 

c)  Przygotowanie roztworów do pomiarów zmętnienia: 

Do ponumerowanych falkonów wlewamy za pomocą pipet (szklanej lub automatycznej) 
wodę destylowaną i r-r siarczanu amonu w ilościach podanych w tabeli 1, a następnie do 
każdego falkonu po 2 ml roztworu białka. Roztwór mieszamy i po 3 min pobieramy 3 ml 
(pipetą Pasteura) do kuwety polistyrenowej i mierzymy jego zmętnienie (patrz punkt d). 
Równolegle dokonujemy pomiaru przewodnictwa  roztworów. Wyniki notujemy w zeszycie 
laboratoryjnym. 

 
Tabela 1. Przygotowanie roztworów do pomiarów zmętnienia i przewodnictwa. 

Nr 

1 

2 

3 

4 

5 

6 

7 

8 

9 

10 

11 

12 

13 

14 

15 

H

2

O [ml] 

10,0  9,7  9,3  9,0  8,7  8,3  8,0  7,7  7,3  7,0  6,7  6,3  6,0  5,7  5,3 

Siarczan amonu 

[ml] 

4,0  4,3  4,7  5,0  5,3  5,7  6,0  6,3  6,7  7,0  7,3  7,7  8,0  8,3  8,7 

0,5% r-r żelatyny 

[ml] 

2,0  2,0  2,0  2,0  2,0  2,0  2,0  2,0  2,0  2,0  2,0  2,0  2,0  2,0  2,0 

Absorbancja 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Transmitancja 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Przewodnictwo 

roztworu* 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

* wpisać wartość odczytaną z konduktometru 
 

d)  Pomiar zmętnienia: 

1.  Wstawić do komory pomiarowej spektrofotometru kuwetę napełnioną 3 ml wody 

destylowanej – jest to próbka referencyjna, następnie zamknąć pokrywę. 

2.  Nastawić długość fali na 500 nm. postępując zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia. 

Zmierzyć w ten sposób próbę ślepą w trybie absorbancja. 

3.  Włożyć kuwetę napełnioną 3 ml roztworu białka, zamknąć pokrywę pomiarową, 

następnie dokonać pomiaru.  

4.  Całość powtórzyć dla trybu transmitancji.  

 

e)  Po wykonaniu całej serii pomiarów dodać kolejne 2 ml białka i powtarzamy pomiary. 

 
 
5. 

PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW: 

Laboratorium  Fizjologii  

WYZNACZANIE  PUNKTU  KOAGULACJI  BIAŁEK  

SPOWODOWANYCH  OBECNOŚCIĄ  SOLI

 

3  

 

1.  W tabeli przedstawić: stężenia siarczanu amonu i białka; odczytane wartości absorbancja 

i transmitancji oraz odpowiadające im wartości przewodnictwa. 
 
 

2.  Sporządzić wykres absorbancji [a.u.] w funkcji przewodnictwa roztworu. 
3.  Z wykresów wyznaczyć minimalną przewodność r-r siarczanu amonu potrzebną do 

wysolenia 50, 80 i 95%  mierzonego białka. Czy zwiększenie stężenia białka ma wpływ 
na te punkty? 

 
Bibliografia: 
http://biochigen.sum.edu.pl/praktikum/012.pdf 
 
Opracował: 
mgr. inż. Jan Procek