plik

Postępy Biochemii 58 (3) 2012

273

Joanna Drozdowska

Warszawski Uniwersytet Medyczny, Wydział

Nauki o Zdrowiu, Zakład Biochemii Ogólnej i

Żywności, Warszawa

Warszawski

Uniwersytet

Medyczny,

Wydział Nauki o Zdrowiu, Zakład Biochemii

Ogólnej i Żywności, ul. Żwirki i Wigury 61,

02-091 Warszawa; tel.: (22) 599 18 35, e-mail:

jdrozdowska@wum.edu.pl

Artykuł otrzymano 13 lutego 2012 r.

Artykuł zaakceptowano 10 maja 2012 r.

Słowa kluczowe: czynnik tkankowy, TF, asTF,

latentny TF, śródbłonek, HUVEC

Wykaz skrótów: asTF (ang. alternatively spli-

ced Tissue Factor) — rozpuszczalna izoforma

czynnika tkankowego; flTF (ang. full length

Tissue Factor) — błonowy czynnik tkankowy;

HUVEC — komórki izolowane z ludzkiej żyły

pępowinowej (ang. Human Umbilical Vein En-

dothelial Cells); IL-1β (ang. Interleukin-1 β) — in-

terleukina pierwsza beta; LPS (ang. lipopolysac-

charide) — lipopolisacharyd; PDI (ang. Protein

Disulfide Isomerase) — izomeraza disulfidowa;

PS — fosfatydyloseryna; TF (ang. Tissue Fac-

tor) — czynnik tkankowy; TNFα (ang. Tumour

Necrosis Factor α) — czynnik martwicy nowo-

tworów alfa; VEGF (ang. Vascular Endothelial

Growth Factor) — czynnik wzrostu komórek

śródbłonka naczyniowego

Czynnik tkankowy w komórkach śródbłonka —

budowa i funkcja w świetle wyników najnowszych badań

STRESZCZENIE

zynnik tkankowy (TF) jest glikozylowanym białkiem błonowym wytwarzanym przez śród-

błonek i wiele innych komórek. Najlepiej poznaną jego rolą jest inicjacja procesu tworze-

nia skrzepu po uszkodzeniu naczynia, następująca po połączeniu z VII czynnikiem krzepnięcia

krwi, ale równie ważny jest udział TF w procesach zapalnych. W artykule przedstawiono aktu-

alny stan wiedzy na temat regulacji syntezy TF w komórkach śródbłonka. Przedstawiono też

poglądy dotyczące nieaktywnej formy TF oraz mechanizmów prowadzących do jej aktywacji.

WPROWADZENIE

Czynnik tkankowy (TF, ang. Tissue Factor) zwany inaczej tromboplastyną, czynni-

kiem III krzepnięcia krwi (F3, ang. Factor 3) lub CD 142 (ang. Cluster of Differentiation

142), jest 47 kDa glikoproteiną zakotwiczoną w błonie komórkowej. Pełni on istotną

rolę w procesach krzepnięcia i jego obecność w błonie komórkowej jest ściśle kontro-

lowana. TF uzyskuje kontakt z krwią między innymi, gdy dochodzi do uszkodzenia

naczynia krwionośnego i ekspozycji fibroblastów i miocytów mięśniówki gładkiej

(subendotelium). Jednak w przeciwieństwie do wspomnianych powyżej komórek

subendotelium konstytutywnie wytwarzających TF [1], nieaktywowane komórki

śródbłonka i monocyty nie wytwarzają TF. W komórkach tych pojawia się on w

formie aktywnej dopiero po ich stymulacji np. TNFα, IL-1β, LPS (odpowiednio, ang.

Tumour Necrosis Factor α, Interleukin-1 β, lipopolysaccharide).

Proces tworzenia skrzepu przebiega przy udziale kilkunastu czynników krzep-

nięcia, które są proteazami serynowymi aktywowanymi po proteolizie fragmentów

swoich cząsteczek. Pierwszy etap kaskady krzepnięcia następuje po związaniu TF

ze stale obecnym we krwi czynnikiem VII. W wyniku tej reakcji powstaje aktywny

czynnik VII (VIIa). Kompleks VIIa/TF aktywuje czynnik X, który w kolejnych reak-

cjach z udziałem V czynnika krzepnięcia indukuje przekształcenie protrombiny w

trombinę. Trombina następnie aktywuje fibrynę i tworzy się skrzep (Ryc. 1).

Opisana powyżej rola TF w krzepnięciu krwi jest dobrze poznana i udoku-

mentowana [2,3]. W ostatnich latach coraz więcej uwagi zwraca się jednak na

inną, ważną funkcję tego białka. Bierze ono udział w szlakach przekazywania

sygnału angażujących

białka PAR (ang. Pro-

tease-Activated Recep-

tors) i regulujących

m.in. odpowiedź za-

palną,

angiogenezę

oraz tworzenie prze-

rzutów nowotworo-

wych [4-10]. Rola TF

w szlakach przekazy-

wania sygnału nie bę-

dzie omawiana w tym

artykule.

Oprócz TF obecne-

go na powierzchni ko-

mórek, jego obecność

stwierdza się także we

krwi obwodowej. Na

frakcję rozpuszczal-

nego, osoczowego TF

składa się uwalniane

z komórek rozpusz-

Rycina 1. Kaskada aktywacji czynników krzepnięcia krwi prowadzą-

ca do polimeryzacji fibryny. TF oddziałuje z czynnikiem VII tworząc

kompleks zdolny do proteolizy czynnika X, który następnie aktywuje

czynnik V. Protrombina przekształcana jest w trombinę dzięki proteoli-

tycznym właściwościom kompleksu utworzonego przez czynnik X oraz

czynnik V. Trombina aktywuje fibrynogen, który polimeryzuje i staje się

elementem skrzepu, fibryną.

274

www.postepybiochemii.pl

czalne białko pozbawione domeny transbłonowej (asTF,

ang. alternatively spliced Tissue Factor) oraz TF związany z

błoną komórkową mikrocząstek (MPs, ang. microparticles,

microvesicles) czyli bardzo drobnych fragmentów błon ko-

mórkowych uwalnianych przez różne typy komórek i płyt-

ki krwi. Funkcja i pochodzenie osoczowego TF nadal budzi

wiele kontrowersji [2,11-14]. Pojawiły się także wątpliwości

dotyczące mechanizmów aktywacji procesów krzepnięcia

z udziałem TF. W świetle bieżących doniesień wydaje się,

że samo pojawienie się TF na powierzchni komórek śród-

błonka nie warunkuje zapoczątkowania procesów tworze-

nia skrzepu, jak zakłada to klasyczny model [3,15-17]. Nie

została również ustalona rola rozpuszczalnej izoformy TF

(asTF). Wydaje się, że może ona pełnić rolę czynnika angio-

gennego i sprzyjać metastazie komórek nowotworowych.

Zjawiska te wymagają jednak dalszych badań.

Tematem niniejszej pracy jest regulacja wytwarzania

izoformy błonowej i rozpuszczalnej TF oraz jego aktywa-

cja w komórkach śródbłonka. Ze względu na ograniczenia

techniczne wiele doświadczeń dotyczących ekspresji genu

kodującego TF oraz uaktywnienia jego latentnej formy zo-

stało przeprowadzonych na innych niż śródbłonek komór-

kach. Zebrane dane zostały jednak tak przedstawione, aby

przybliżyć czytelnikom mechanizmy i zjawiska dotyczące

przede wszystkim komórek śródbłonka.

REGULACJA EKSPRESJI GENU TF

Gen kodujący TF u człowieka znajduje się na pierwszym

chromosomie i należy do grupy genów wczesnej odpowie-

dzi (IEG, ang. immediate early genes). Indukcja jego ekspresji

przebiega bezpośrednio w odpowiedzi na czynnik stymu-

lujący, bez wcześniejszej syntezy de novo innych białek. Sys-

tem regulacji wytwarzania TF w śródbłonku jest inny niż

w komórkach subendotelium. Różnica polega na tym, że

nieaktywowany śródbłonek nie wytwarza TF. Rozpoczęcie

ekspresji genu następuje dopiero w odpowiedzi na stymu-

lację, np. cytokinami. Natomiast w komórkach mięśni gład-

kich naczyń jest on wytwarzany stale [2]. Badania mające

na celu ustalenie mechanizmów regulacji transkrypcji genu

dla TF przeprowadzono na komórkach wykazujących jego

stałą, wysoką ekspresję. W dalszej części rozdziału opisa-

no, w jaki sposób dochodzi do indukcji syntezy mRNA tego

białka w śródbłonku.

Analiza struktury genu TF wykazała, że aktywną kontro-

lę jego transkrypcji umożliwiają znajdujące się w promoto-

rze liczne odcinki podatne na metylację uniemożliwiającą

przyłączenie białek kompleksu transkrypcyjnego. W pro-

motorze znajdują się również miejsca wiązania czynników

transkrypcyjnych (elementy regulatorowe cis), które od-

działują ze specyficznymi białkami umożliwiając utworze-

nie kompleksu transkrypcyjnego. W obszarze promotora

genu kodującego TF znajdują się dwa miejsca AP-1(-217 i

-204 ), jedno κB (-179) oraz trzy Sp1/Egr1.

Badania przeprowadzone na komórkach izolowanych z

ludzkiej żyły pępowinowej (HUVEC, ang. Human Umbili-

cal Vein Endothelial Cells) wykazały, że miejsca AP-1 są na

stałe związane z heterodimerami Fos-Jun [18]. Konstytu-

tywną obecność czynników trans w wymienionych miej-

scach potwierdziły także dane otrzymane z komórek śród-

błonka aorty świni (PAEC, ang. Pig Aortic Endothelial Cells)

[19]. Sprzeczne z nimi są wyniki badań przeprowadzonych

przez innych badaczy. Wskazują one indukcyjność wiąza-

nia hererodimerów Fos/JunD do jednego z miejsc AP-1 po

stymulacji TNFα. Analiza kompleksów czynników wiążą-

cych się z miejscami AP-1 ujawniła różny dla obu miejsc

skład oddziałujących białek [20].

Z kolei do miejsc κB, po stymulacji bakteryjną endotok-

syną (lipopolisacharydem, LPS) lub cytokinami, rekrutowane

są czynniki transkrypcyjne NF-κB składające się z białek

Rel. Ich nazwa wywodzi sie od homologicznej domeny o

takiej samej nazwie (RDH, ang. Rel homology domain). Struk-

tura motywu κB w promotorze genu TF zawiera w pozycji

pierwszej C zamiast G co sprawia, że nie może z nią oddzia-

ływać kompleks p50-p65, natomiast preferencyjnie wiąże

się c-Rel-p65 [18]. Warto zauważyć, że oba białka uprzy-

wilejowanego heterodimeru zawierają domenę TAD (ang.

Transcriptional Activation Domain) umożliwiającą aktywację

transkrypcji [21]. Przed pojawieniem się sygnału aktywują-

cego, białka Rel, znajdują się w cytoplazmie w formie nie-

aktywnej. Tworzą one kompleks z białkami hamującymi

IκBα, które przysłaniają fragment domeny Rel, zawierającej

informację o transporcie do jądra komórkowego (NLS, ang.

Nuclear Localization Signal). Ufosforylowanie białek inhibito-

rowych przez odpowiednią kinazę np. IκBK powoduje ich

dysocjację, odsłonięcie sekwencji sygnałowej i transport do

jądra komórkowego [21].

Doświadczenia wykazały, że białka przyłączane do

miejsc κB i AP-1 mogą ze sobą oddziaływać, tworząc frag-

ment kompleksu inicjującego transkrypcję genu TF w odpo-

wiedzi na LPS, TNFα i IL-1β [18-20]. Fragment promotora

zawierający dwa miejsca AP-1 i κB nazywany jest elemen-

tem LRE (ang. LPS Responce Element) [22]. Inne badania

dowiodły, że elementy kompleksu transkrypcyjnego NFκB

mogą także oddziaływać z Sp1[18].

Elementami trans wiążącym się z trzema miejscami

Sp1 jest konstytutywnie syntetyzowane białko Sp1 (ang.

Specificity protein 1) zawierające w swojej strukturze trzy

palce cynkowe, którymi wiąże się z DNA. Badania prze-

prowadzone na komórkach linii nowotworowej HeLa

wskazują, że przyłączenie dwóch Sp1 jest konieczne, aby

utrzymać aktywność promotora TF. Sp1 bierze udział w

inicjacji powstania kompleksu transkrypcyjnego w odpo-

wiedzi na czynniki wzrostu, a obszar na którym się znaj-

duje ( -111 do +14) nazwano SRR (ang. Serum Response

Region). Warto podkreślić, że w tym fragmencie zlokali-

zowane są również trzy miejsca, do których możliwe jest

przyłączenie kolejnego elementu trans Egr-1 (ang. Early

growth response protein 1). Odcinki te zachodzą na obsza-

ry wiązania Sp1 sześcioma parami zasad. Wydaje się, że

wymienione czynniki transkrypcyjne konkurują ze sobą

o miejsce wiązania [22]. Sekwencje nukleotydów w obrę-

bie miejsc regulatorowych dla genu TF nie są zachowane

w ewolucji. Jak wykazano, występuje zróżnicowanie ga-

tunkowe w składzie białkowych kompleksów rekrutowa-

nych do miejsc AP-1 w odpowiedzi na cytokiny [19,20].

Być może dotyczy to również innych elementów regula-

torowych w obrębie genu TF.

Postępy Biochemii 58 (3) 2012

275

ROZPUSZCZALNA IZOFORMA

CZYNNIKA TKANKOWEGO

Tradycyjnie TF jest opisywany jako transbłonowe białko

występujące na powierzchni śródbłonka i innych komórek, nie

jest to jednak jego jedyna forma. We krwi obecna jest frakcja

tego białka nie związana z komórkami ani płytkami krwi, na-

zwana rozpuszczalnym TF albo osoczowym TF. Tworzą go TF

związany z powierzchnią mikrocząstek oraz asTF (lub asHTF;

ang. alternatively spliced Tissue Factor), czyli forma TF, którego

transkrypt uległ alternatywnemu różnicowemu cięciu i skła-

daniu (ang. splicing), w wyniku czego nie jest kotwiczony w

błonie komórkowej. Badania przeprowadzone na komórkach

śródbłonka aktywowanych TNFα lub IL-6 ujawniły, że oprócz

klasycznego TF (flTF, ang. full length Tissue Factor) syntezują

one również jego rozpuszczalną izoformę [23].

Wprawdzie w komórkach śródbłonka nie analizowano

struktury transkryptu asTF, ale doświadczenia przeprowa-

dzone na komórkach linii HL-60 (mieloblastów ostrej bia-

łaczki promieloblastycznej) i monocytach CD 14

, ujawniły,

że jego alternatywna forma nie zawiera eksonu 5 odpowia-

dającego domenie transbłonowej i cytoplazmatycznej [4].

Ekson 4 jest dołączony do eksonu 6, który rozpoczyna się

„niekompletnym” kodonem. W wyniku przesunięcia ramki

odczytu powstaje specyficzny dla asHTF C koniec. Składa

się on z pierwszych 166 reszt aminokwasowych transbłono-

wej formy oraz ciągu 40 reszt aminokwasowych unikalnych

dla TF. Opisane powyżej modyfikacje sprawiają, że mRNA

asTF jest o 160 nukleotydów krótszy od pełnej formy.

Rola TF w procesach tworzenia skrzepu przy udziale ko-

mórek śródbłonka została dość dobrze poznana, ale funkcja

asTF nadal pozostaje zagadką. W literaturze pojawiają się

na ten temat różne hipotezy. Według niektórych badaczy

asTF ułatwia powstawanie rozległego skrzepu [24], inni

zaś w ogóle poddają w wątpliwość jego zdolności proko-

agulacyjne [25]. Wiadomo także, że u ludzi jego synteza nie

jest jednakowa we wszystkich narządach. W płucach sto-

sunek liczby kopii mRNA asTF do flTF jest podwyższony

w stosunku do nerek, serca czy mózgu. Wyjaśnienie tego

zjawiska może pomóc w zidentyfikowaniu mechanizmów

kontrolujących powstawanie rozpuszczalnej formy TF, jak

również w ustaleniu jego funkcji [4, 23].

Na całkowitą pulę osoczowego TF składa się antygen odpo-

wiadający skróconej formie TF (10–30%) oraz TF o pełnej dłu-

gości związany z błoną mikrocząstek. Wydaje się jednak, że w

miejscu działania cytokin asHTF pełni nieco odmienną rolę niż

ten zlokalizowany w błonie komórkowej. Badania przeprowa-

dzone na komórkach śródbłonka izolowanych z ludzkiej żyły

pępowinowej ujawniły zróżnicowaną dynamikę wytwarzania

obu form białka. Komórki te odpowiadają szybką i intensyw-

ną syntezą asHTF (45-krotny wzrost) po upływie zaledwie 10

minut od stymulacji TNFα. Następnie białko to jest uwalniane

z komórki. Najwyższy poziom ekspresji genu kodującego bło-

nowy TF stwierdzano dopiero po 1 godzinie stymulacji cytoki-

ną [23]. Powstała więc hipoteza, według której pod wpływem

czynnika prozapalnego dochodzi najpierw do uwolnienia

asHTF z komórki, natomiast później aktywność prozakrzepo-

wa uzależniona jest od flTF występującego na mikrocząstkach

[23]. W świetle badań dotyczących właściwości latentnego TF

(patrz poniżej) wydaje się ona jednak nieprawdziwa. Autorzy

opisanych badań sugerują, że wczesne uwolnienie asHTF z ko-

mórki może być związane z przygotowaniem warunków do

szybszego stworzenia skrzepu. Po pojawieniu się w środowi-

sku cytokiny zmniejsza się wytwarzanie inhibitora TF (TFPI,

ang. Tissue Factor Pathway Inhibitor), jednak pewna jego ilość

nadal jest obecna we krwi. Skrócona forma TF mogła by two-

rzyć kompleks z czynnikiem VII i wiązać TFPI, przez co cała

pula TF związanego z błoną brałaby udział w procesie krzep-

nięcia. Hipoteza ta ma potwierdzenie w dynamice wytwarza-

nia obu form mRNA dla białka, czyli następującą w czasie re-

dukcją liczby wytwarzanych transkryptów dla asTF oraz ich

podwyższoną produkcją dla flTF [23]. W opisanych badaniach

do wyrażenia właściwości prozakrzepowych asTF wymagała

obecności fosfatydylocholiny i fosfatydyloseryny [23]. Donie-

sienia te potwierdzają wcześniejsze obserwacje wskazujące,

że prozakrzepowe właściwości kompleksu TF/czynnik VII

wymagają obecności ujemnie naładowanych fosfolipidów, o

czym będzie mowa w następnym rozdziale.

Kolejnym dowodem świadczącym o właściwościach pro-

koagulacyjnych asTF jest jego obecność w wytworzonym i w

tworzącym się ex vivo skrzepie. Zaproponowano więc nowy

model jego powstawania, w którym rozpuszczalna forma

TF pełni ważną funkcję w jego propagacji. TF związany z

błoną komórkową śródbłonka, w miarę przyłączania czyn-

ników krzepnięcia krwi (VII, IV, X) oraz płytek krwi, ulega

fizycznemu odseparowaniu od krwi przez co nie może peł-

nić swojej protrombotycznej funkcji. Uwolniony do światła

naczynia rozpuszczalny asHTF łączy się z czynnikiem VII

tworząc aktywny kompleks, a dzięki temu, że nie jest zwią-

zany z błoną plazmatyczną, oddziałuje z płytkami krwi i re-

krutuje w to miejsce kolejne cząsteczki fibryny [24].

Niektórzy badacze zakwestionowali jednak rolę asHTF

jako czynnika krzepnięcia, gdyż jego potencjał do genero-

wania aktywnego czynnika X jest mniejszy niż ten prezen-

towany przez flTF [4,23]. Nie jest ponadto jasne, jak pozba-

wiona domeny transbłonowej izoforma TF miałaby oddzia-

ływać ze związanym z błoną komórkową czynnikiem X.

Przeprowadzone badania sugerują, że białko to pełni raczej

rolę inhibitorową i zmniejsza pulę czynnika VII, z którym

flTF tworzy aktywny kompleks. Istnieje ogromna różnica

pomiędzy stężeniami asHTF i czynnika VII obecnymi we

krwi a stężeniami niezbędnymi do wywołania ich niewiel-

kiej proteolitycznej aktywności [4,26].

Inne doświadczenia przeprowadzone na komórkach

śródbłonka ujawniły, że asTF może pełnić odmienną niż

flTF funkcję. Komórki te w obecności podwyższonego stę-

żenia rozpuszczalnej formy TF intensywniej migrowały i

wykazywały szereg innych cech wskazujących na aktyw-

ność angiogenną asTF. Efekt ten był niezależny od czynnika

VII [27]. Skrócona forma TF łączy się z integrynami obecny-

mi na powierzchni błony komórkowej, aktywując migrację

i tworzenie kapilar. Co ciekawe, oddziaływanie TF z różny-

mi integrynami wywołuje odmienną odpowiedź komórko-

wą. Migracja następuje w skutek oddziaływania asTF z inte-

gryną αvβ3 i fosforylacji białek przekaźnikowych p38 MAP

i PI3 kinazy. Tworzenie kapilar jest natomiast zależne od

połączenia asTF z integrynami α6β1, a następnie aktywacji

kinazy p42/p44 MAP i kinazy Akt. Klasyczna, pełna forma

276

www.postepybiochemii.pl

TF również może łączyć się z integrynami, jednak reakcja ta

przebiega z zaangażowaniem receptora PAR2 [28].

Uwalnianie asTF wykryto w wielu typach komórek no-

wotworowych, co wzmacnia hipotezę o jego udziale w an-

giogenezie [27-29]. W modelu doświadczalnym wykorzy-

stującym komórki nowotworu trzustki transfekowane asTF

wykazano, że białko to znacząco nasilało powstawanie wo-

kół nich sieci naczyń krwionośnych oraz rozrost guza [29].

Jego angiogenny potencjał potwierdzają również doświad-

czenia z użyciem matriżelu zawierającego zrekombinowa-

ny asTF, który był wszczepiony myszom. Z badań wynika,

że intensywność angiogenezy indukowanej przez asTF była

porównywalna do odpowiedzi wywołanej przez VEGF

(ang. Vascular Endothelial Growth Factor) [27]. Autorzy tych

badań sugerują także, że asTF może wpływać na utratę in-

tegralności blaszki miażdżycowej poprzez udział w tworze-

niu unaczynienia własnego dużych naczyń krwionośnych,

vasa vasorum. Przypuszczenia takie powstały po wykryciu

jego obecności w płytce miażdżycowej. Wyjaśnienie tego

zjawiska wymaga jednak dalszych badań [27].

Istnieją jednak prace dowodzące, że asTF nie wpływa bez-

pośrednio na procesy angiogenezy, a pośrednio. Wykazano,

że nadproducja asTF w linii mysich kardiomiocytów (HL-1),

indukuje syntezę czynników angiogennych i nasilających mi-

grację komórek, FGF2 (ang. Fibroblast Growth Factor-2), Cyr61

(ang. Cysteine-rich 61) i VEGF. Wytwarzanie tych białek pod-

lega regulacji przez ERK 1/2 i p38 MAP w odpowiedzi na

aktywację PAR1 i PAR2 [30]. Doniesienia świadczące o wtór-

nym działaniu asTF nie przeczą wynikom doświadczeń z

użyciem matriżelu z asTF, gdyż były one przeprowadzane

na modelu mysim, a nie in vitro. Nie można zatem wykluczyć

wpływu FGF2, Cyr61 i VEGF na tworzenie naczyń krwiono-

śnych oraz proliferację śródbłonka.

Nie jest do końca wyjaśnione, jak powstaje alternatyw-

na forma TF. Wydaje się jednak, że proces ten w śródbłon-

ku i w innych komórkach powinien przebiegać podobnie.

Cząsteczka pre-mRNA TF zawiera motywy sekwencyjne

i strukturalne, które biorą udział w przebiegu różnicowe-

go cięcia i składania mRNA. Fragmenty transkryptu okre-

ślane jako SRE (ang. Splicing Regulatory Elements) regulują

jego obróbkę oddziałując z białkami hnRNP (ang. hetero-

geneous nuclear Ribonucleoproteins) i SR (ang. Serine- and

arginine-Rich proteins) [31]. W eksonie 5 pre-mRNA dla

TF znajduje się pięć sekwencji ESE (ang. Exon Splicing En-

hanser), z którymi mogą się wiązać ufosforylowane białka

SF2/ASF (ang. Splicing Factor 2/Alternative Splicing Factor)

oraz jedno miejsce dla białek SR -SRp75 (ang. Serine and

arginine Rich protein 75) [32,33] lub/i SRp55 [27,34]. Do-

wiedziono, że wymienione czynniki transkrypcyjne biorą

udział w regulacji obróbki transkryptów dla dwóch izo-

form TF w komórkach śródbłonka. Doświadczenia polega-

ły na stymulowaniu TNFα komórek HUVEC i wyciszaniu

transkryptów poszczególnych SR. Badania wykazały, że

obecność ufosforylowanych SR75 i SF2/ASF wpływa na

zwiększenie liczby transkryptów dla flTF [32]. Doniesie-

nia te są w pewnym stopniu zgodne z wynikami badań

przeprowadzonych na monocytach stymulowanych LPS.

W komórkach tych wycinanie eksonu 5 z transkryptu

TF zależy od konkurujących ze sobą o miejsce wiązania

SRp40/SC35 – SC55 oraz SC35 - SF2/ASF. Białkami biorą-

cymi udział w tworzeniu mRNA dla asTF są zatem SRp40

i SC35, natomiast dla flTF SF2/ASF i SR55. Autorzy suge-

rują, że SRp75, którego rolę odkryto przy regulacji różni-

cowego cięcia i składania mRNA w komórkach HUVEC,

pełni raczej funkcje pomocnicze niż kluczowe przy two-

rzeniu spiceosomu [34].

Proces alternatywnego różnicowego cięcia i składania

mRNA nie tylko zależy od przyłączenia odpowiednich bia-

łek regulatorowych, ale również, a może przede wszystkim

od ich aktywacji przez odpowiednie kinazy. Kontrolowa-

nie procesowania pre–mRNA dla TF przez kinazy jest zło-

żone, hierarchiczne i zależne od wielu czynników. Badania

ujawniły, że białkami biorącymi udział w uaktywnianiu

elementów spiceosomu są prawdopodobnie Clk (ang. Cdc2-

-like kinase), DNA topoizomeraza I (DNA Topo I), p38 MAP

i białka szlaku przekazywania sygnału PI3/Akt [23,32,33].

Aktualne dane wskazują, że kinaza Akt 2 może oddziały-

wać na białka SR bezpośrednio, tak jak się to dzieje się w

przypadku czynnika SF2/ASF [33,35] lub pośrednio, po-

przez aktywację innej kinazy, Clk, która fosforyluje SRp75,

SRp55 [35] i SF2/ASF [32]. Farmakologiczne zahamowanie

aktywności Clk powoduje spadek liczby transkryptów dla

obu izoform TF i hypofosforylację SF2/ASF, SRp55, SRp75

[32]. W innych badaniach ten sam autor pokazał, że po ak-

tywacji komórek śródbłonka przez TNFα, ufosforylowa-

nie SF2/ASF, SRp75 i SRp55 jest regulowane przez białka

szlaku PI3K/Akt. Ich hamowanie jednak nie prowadzi do

zmniejszenia liczby transkryptów dla flTF [33].

W proces regulacji alternatywnej obróbki transkryptu

dla TF może być zaangażowana również kinaza p38 MAP,

która bierze udział w organizacji przestrzennej czynników

uczestniczących w procesowaniu mRNA. Białka hnRNP A1

i SF2/ASF są antagonistami i konkurują ze sobą o miejsce

wiązania. Badania przeprowadzone na stymulowanych

TNFα komórkach śródbłonka ujawniły, że kinaza p38 MAP

fosforyluje hnRNP A1, w wyniku czego następuje eksport

tej nukleoproteiny z jądra do cytoplazmy [23]. Dzięki opisa-

nej translokacji białko SF2/ASF może swobodnie oddziały-

wać z białkami splicesomu, pre-mRNA i regulować powsta-

nie alternatywnego transkryptu.

Nie ma jeszcze żadnych badań potwierdzających, że ki-

nazy ścieżek PI3/Akt i p38 MAP oddziałują ze sobą podczas

procesu obróbki transkryptu dla TF. Przedstawione dane

sugerują jednak nadrzędną role ścieżki PI3K/Akt w regu-

lacji całego alternatywnego różnicowego cięcia i składania

mRNA TF. Zależności te wydają się jednak skomplikowane,

a wymieniony mechanizm może regulować powstawanie

zarówno asTF, jak i flTF.

W proces alternatywnego różnicowego cięcia i składa-

nia mRNA TF zaangażowana jest również DNA Topo I.

Hamowanie tego białka pociąga za sobą obniżenie liczby

aktywnych form SF2/ASF i SRp55 oraz spadek liczby trans-

kryptów flTF, a wzrost asTF. Powstały przypuszczenia, że

DNA Topo I reguluje fosforylację SF2/ASF i SRp55 [32]. Nie

wiadomo, czy aktywność tego białka w procesie alterna-

tywnego różnicowego cięcia i składania mRNA TF jest re-

gulowana przez kinazy.

Postępy Biochemii 58 (3) 2012

277

Regulacja alternatywnego różnicowego cięcia i składania

mRNA TF jest złożona i prawdopodobnie hierarchiczna. Na-

dal jednak mało o niej wiemy. Zebrane dane są niewystarcza-

jące, by móc stwierdzić, jak przebiega proces tworzenia trans-

kryptów obu form TF. Konieczne są zatem dalsze badania.

UTAJONY TF

Do niedawna sądzono, że synteza TF w komórkach

śródbłonka możliwa jest dopiero po ich aktywacji. Jednak

w świetle ostatnich badań ten klasyczny model wydaje się

być błędny [15,17]. Stwierdzono bowiem, że w błonie ko-

mórkowej niestymulowanych komórek występuje TF, który

jest wykrywany przez przeciwciała, lecz nie wykazuje ak-

tywności prozakrzepowej (nieaktywny, latentny, utajony,

uśpiony, ang. encripted, cryptic TF). Wiąże się on z czynni-

kiem VII/VIIa, jednak wytworzony kompleks nie ma zdol-

ności do przyłączenia i oddziaływania ani z czynnikiem X

ani z TFPI. Obecność uśpionego TF potwierdzono także w

innych niż śródbłonek komórkach, np. w HL-60 (ang. Hu-

man promyelocytic Leukemia cells) [3], monocytach [3,16] oraz

fibroblastach [36]. Okazało się, że nieaktywny TF występuje

także, gdy jego transkrypt zostanie wprowadzony do komó-

rek nie wytwarzających go de novo [37]. Dane te dowodzą,

że występowanie latentnej formy białka prawdopodobnie

jest właściwą jemu cechą.

Proces uaktywnienia TF w komórkach śródbłonka nastę-

puje prawdopodobnie po ich stymulacji, nie jest jednak na-

dal jasne, jaki jest mechanizm tego zjawiska. Wiadomo jed-

nak, że latentny TF związany z błoną komórkową zyskuje

proteolityczne właściwości w komórkach ulegających pro-

cesom apoptotycznym. Naukowcom udało się opracować

sposób sztucznego wzbudzania aktywności proteolitycznej

TF poprzez traktowanie komórek jonoforami (np. wapnio-

wym) oraz silnymi utleniaczami np. chlorkiem rtęci (II) lub

cykloheksymidem. Zastosowanie tych związków powoduje

wzrost liczby cząsteczek TF wyrażających właściwości pro-

zakrzepowe bez wpływu na jego syntezę czy obecność anty-

genu na powierzchni błony komórkowej [37,38]. Nadal nie

zostało ostatecznie rozstrzygnięte, jaki mechanizm reguluje

przemianę latentnego TF w aktywny i odwrotnie. Wiadomo

natomiast, że pewna liczba tej formy TF jest zawsze obecna

w błonie komórkowej. Wymienia się szereg mechanizmów,

które mogłyby odpowiadać za zjawisko uśpienia TF. Ogól-

nie można je podzielić na związane ze strukturą samego

białka oraz umiejscowieniem go w obrębie domen błony

komórkowej. Należy dodać, że mechanizmy te nie wyklu-

czają się wzajemnie.

WPŁYW STRUKTURY TF NA JEGO AKTYWACJĘ

TF jest przedstawicielem superrodziny receptorów cy-

tokin. Cechą charakterystyczną tej grupy białek jest zdol-

ność do tworzenia homodimerów i przyłączania swoistych

ligandów [3]. W przeciwieństwie jednak do pozostałych

członków swojej rodziny, dimeryzacja podjednostek TF ha-

muje jego aktywność. Analiza czwartorzędowej struktury

kompleksu TF/czynnik VII wykazała, że homodimer TF ma

zdolność do przyłączania czynnika VII, ale nie czynnika X.

Miejsce wiązania czynnika X w tym kompleksie jest przy-

słonięte, co oznacza zablokowanie jego funkcji prozakrze-

powych. Powyższe dane sugerują, że jedynie monomerycz-

na forma TF jest zdolna do udziału w procesie wytwarza-

nia skrzepu [3]. TF, podobnie jak inni członkowie rodziny

receptorów klasy II cytokin, łączy się z ligandem, którym

jest czynnik VII (Ryc. 1). Badania strukturalne ujawniły, że

wiązanie disiarczkowe w cząsteczce TF, występujące po-

między resztami Cys 186 i Cys 209 (Ryc. 2), jest niezbędne

do prawidłowego wiązania czynnika VII oraz wyrażenia

aktywności prokoagulacyjnej kompleksu [39]. Aminokwasy

te znajdują się w domenie zewnątrzkomórkowej, a wiąza-

nie pomiędzy nimi pełni funkcje regulatora struktury trze-

ciorzędowej cząsteczki wiążąc sąsiadujące ze sobą nici w β

kartce [10]. Okazało się, że aktywna prozakrzepowo forma

TF obecna w błonie komórkowej śródbłonka, wymaga utle-

nienia siarki i powstania mostku disiarczkowego pomię-

dzy resztami cystein [10,39]. Enzymem, który mógłby taką

reakcję katalizować jest izomeraza disulfidowa (PDI, ang.

Protein Disulfide Isomerase). Badania potwierdziły jej zdol-

ność do podwyższania aktywności prozakrzepowej TF [40],

ale sam mechanizm tej aktywacji wywołał wiele dyskusji,

głównie ze względu na umiejscowienie tego enzymu w ob-

rębie komórki [10,41]. PDI zawiera sekwencję sygnałową

KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu), która powinna utrzymywać ją w

siateczce endoplazmatyczej. Wiadomo jednak, że znajduje

się ona w mikrodomenach błony komórek śródbłonka bo-

gatych w cholesterol [42]. Dotychczas nie udało się wyja-

śnić, w jaki sposób PDI przemieszcza się na powierzchnię

błony komórkowej.

Wyniki innych doświadczeń ujawniają obecność i rolę PDI

w miejscu powstawania skrzepu. Zahamowanie jej aktywno-

ści znacząco zmniejszyło polimeryzację fibryny [40]. Powstały

przypuszczenia, że PDI może być uwalniana do przestrzeni

zewnątrzkomórkowej i tam bezpośrednio oddziaływać z TF

na powierzchni śródbłonka i innych komórek. Wydają się one

zasadne choćby ze względu na fakt, że izomeraza disulfidowa

stanowi jedno z głównych białek występujących w błonie mi-

krocząstek [42]. Ich powstawanie jest zależne od tratw chole-

sterolowych [43], które są uwalniane z powierzchni komórek

Rycina 2. Struktura i ułożenie cząsteczki TF w błonie komórkowej. Na rycinie

oznaczono niektóre reszty aminokwasowe i ich modyfikacje występujące w czą-

steczce TF oraz mostki disiarczkowe pomiędzy resztami cystein.

278

www.postepybiochemii.pl

śródbłonka np. po stymulacji cytokinami [23]. Na podstawie

opisanych doniesień został zaproponowany model, w któ-

rym PDI zostaje uwolniona do krwi z zaktywowanych płytek

krwi i tam oddziałuje z TF znajdującym się zarówno na po-

wierzchni komórek śródbłonka, monocytów, jak i mikroczą-

stek [40,44]. Istnieją prace potwierdzające rolę i obecność PDI

w miejscu toczących się procesów prozakrzepowych, a więc

możliwe jest jej oddziaływanie z TF na komórkach śródbłonka.

Nie ustalono jednak dokładnego mechanizmu tego oddziały-

wania. Badania przeprowadzone na myszach wykazały, że

adhezja płytek krwi do ściany uszkodzonego naczynia nie jest

konieczna, aby PDI znalazła się w miejscu tworzenia skrzepu

[40]. Nie musi ona także wpływać na aktywność TF. Warto w

tym miejscu dodać, że naruszenie integralności naczynia po-

ciąga za sobą pojawienie się ujemnie naładowanych fosfolipi-

dów na powierzchni błony komórkowej, co aktywuje TF.

Wyniki badań mających na celu wyizolowanie TF pod-

dają jednak w wątpliwość istnienie w jego strukturze wol-

nych, poddających się utlenieniu przez PDI, grup tiolowych

[10]. Dokładniejsza analiza cząsteczki TF ujawniła jednak,

że reszta cysteiny 209 tego białka może być połączona z glu-

tationem (GSH) [40]. Powstanie tzw. mieszanych disiarcz-

ków (białko-S-S-glutation) ma na celu uchronienie grup -SH

przed nieodwracalnym utlenieniem. Przyłączenie glutatio-

nu może przebiegać według dwóch mechanizmów: utlenie-

nia grup sulfanilowych i ich reakcji z GSH lub reakcji utle-

nionego glutationu z grupami SH. Dla większości białek,

ich glutationylacja prowadzi do zahamowania aktywności

[45]. Wydaje się, że tak też się dzieje w przypadku TF [40].

Powstała hipoteza, według której PDI mogłaby wpływać

na powstanie mostku disiarczkowego pomiędzy resztami

Cys186 i Cys 209 po uprzednim oderwaniu glutatnionu [40].

W oparciu o dostępne dane zaproponowane zostały dwa

mechanizmy oddziaływania TF z izomerazą disulfidową.

Pierwszy opiera się na stworzeniu niestabilnej formy po-

średniej po reakcji N-końcowej reszty cysteiny PDI z resztą

Cys 209 TF. Oddziaływanie to umożliwiłoby powstanie di-

sulfidu. Innym, możliwym mechanizmem jest reakcja izome-

ryzacji grup SH i S-S. Reakcja ta przebiegałaby bez zakłócenia

potencjału redoks PDI, co przyspieszyłoby pojawianie się ak-

tywnych form TF [40]. Jak jednak wskazuje analiza struktury

TF, utlenienie reszt tiolowych w momencie, gdy tworzy on

kompleks z czynnikiem VII, jest niemożliwe. Przyłączony

czynnik VII zasłania bowiem miejsce wiązania reszty cyste-

iny z PDI [46]. Wiadomo natomiast, że forma latentna TF

może tworzyć kompleks z VII czynnikiem krzepnięcia jesz-

cze przed wyrażeniem zdolności do proteolizy czynnika X. A

zatem zaproponowana hipoteza opierająca się na utlenianiu

reszt cystein 186 i 209 przez PDI wydaje się bezzasadna i nie

może wyjaśniać zjawiska uaktywniania TF.

W przedstawionych powyżej doniesieniach badacze sku-

piali się na mechanizmach regulujących przemianę form TF

z utajonej w uaktywnioną i odwrotnie. Istnieje jednak inna

hipoteza, według której w błonie komórkowej znajdują się

dwie, pełniące odmienne funkcje, frakcje TF. Cząsteczki biał-

ka zawierające disulfid miałyby być zaangażowane w procesy

krzepnięcia, zaś forma latentna brałaby udział w przekazywa-

niu sygnału szlakiem TF — aktywny czynnik VII — receptor

PAR2. Rozłączenie mostku disiarczkowego nie jest wymagane,

aby stworzyć kompleks TF-PAR2. Istnienie dwóch, różnych

funkcjonalnie form wyjaśniałoby, dlaczego TF może wyrażać

swoje właściwości prozakrzepowe nie inicjując jednocześnie

odpowiedzi wewnątrzkomórkowej i odwrotnie [39]. W opo-

zycji do powyższej hipotezy stoją dane, według których wią-

zanie pomiędzy resztami cystein w ogóle nie ma wpływu na

aktywację białka. Ma ono jednak znaczenie przy wytwarzaniu

i kotwiczeniu TF w błonie. W doświadczeniach polegających

na wprowadzeniu do komórek śródbłonka transkryptów TF,

w których reszty cysteiny 186 i 209 były zastąpione przez resz-

ty innych aminokwasów, na początku nie wykryto aktywności

protrombotycznych białka. Nabywały ich jednak w obecności

podwyższonego stężenia VII czynnika krzepnięcia. Ponad to

traktowanie tak zmodyfikowanych komórek jonoforem pro-

wadziło do pojawienia się aktywnej formy TF. Gdyby tworze-

nie wiązania disiarczkowego było kluczowym mechanizmem

prowadzącym do uaktywnienia TF opisane zjawiska by nie

wystąpiły [15]. Opisane badania sugerują, że na aktywację TF

w śródbłonku mają wpływ raczej ujemnie naładowane fosfoli-

pidy, a nie tworzące się wiązania disiarczkowe.

WPŁYW UMIEJSCOWIENIA TF W MIKRODOMENACH

BŁONY KOMÓRKOWEJ NA JEGO UAKTYWNIENIE

Aktywacja latentnej formy TF jonoforami i silnymi utle-

niaczami, wywołuje napływ wapnia do komórki. Powoduje

to zmianę lokalizacji ujemnie naładowanych fosfolipidów (w

tym fosfatydyloseryny), które przechodzą z wewnętrznego

do zewnętrznego listka błony komórkowej. Naturalna asy-

metria w rozmieszczeniu lipidów w dwuwarstwie lipidowej

jest utrzymywana przez enzymy, które przenoszą fosfolipidy

z zewnętrznego listka do wewnętrznego (flipazy) i odwrotnie

(flopazy). Zwiększenie stężenia jonów wapnia w cytoplazmie

powoduje zahamowanie aktywności flipaz i uaktywnienie

dodatkowego enzymu transportującego, skramblazy. W wy-

niku tych procesów w listku zewnętrznym błony komórko-

wej zwiększa się frakcja ujemnie naładowanych fosfolipidów.

Przypuszcza się, że to m.in. ten mechanizm prowadzi do zmia-

ny fenotypu śródbłonka na prozakrzepowy. Dobrze znanym

przykładem obrazującym to zjawisko jest stymulacja komórek

cytokinami prozapalnymi. Wiadomo, że związki te zmieniają

właściwości błony komórkowej, powodując przeskok fosfoli-

pidów wewnętrznej warstwy błony, w tym fosfatydylosery-

ny, do listka zewnętrznego [4]. Niewiele jest prac badających

wpływ ujemnie naładowanych fosfolipidów na uaktywnienie

TF na powierzchni komórek śródbłonka. Wydaje się jednak, że

mechanizm ten powinien być uniwersalny. Warto zauważyć,

że obecność PS w listku zewnętrznym błony komórkowej od

dawna jest wykorzystywana do identyfikacji komórek apopto-

tycznych, w których, jak wiadomo, dochodzi do uaktywnienia

latentnej formy TF. Wiadomo również, że zablokowanie prze-

mieszczenia się cząsteczek PS, powoduje obniżenie poziomu

aktywnego TF na monocytach pomimo stymulacji jonoforem

wapniowym [3].

Nie jest jasne, w jaki sposób fosfolipidy miałyby regu-

lować aktywność TF. Być może ich obecność wpływa na

strukturę czwartorzędową lub na orientację białka w błonie

komórkowej poprzez bezpośrednie oddziaływania elektro-

statyczne. Doświadczenia polegające na zastąpieniu reszt

lizyny 165 i 166 resztą alaniny wpłynęły negatywnie na wła-

ściwości proteolityczne TF, pomimo obecności w środowi-

Postępy Biochemii 58 (3) 2012

279

sku PS. Modyfikacja ta nie zmieniła jednak charakterystycz-

nej dla latentnej formy TF zdolności do przyłączania swo-

jego liganda. Wymienione aminokwasy znajdują się blisko

zewnętrznej warstwy błony komórkowej, w pętli nie gra-

niczącej z miejscem wiązania czynnika VII. Umiejscowienie

takie wskazuje na możliwość oddziaływania między PS a

TF. Ujemnie naładowane fosfolipidy mogłyby usztywniać

powstały kompleks TF/czynnik VII, ułatwiając dostęp do

miejsc aktywnych czynnikowi X i zwiększając efektywność

zachodzących reakcji proteolitycznych [3].

Jedna z hipotez wyjaśniających zjawisko uśpienia TF opiera

się na zjawisku jego sekwestracji w mikrodomenach błono-

wych zawierających cholesterol [43] i w kaweolach [10,47].

Cholesterol w błonie komórkowej pełni funkcje modulatora

aktywności wielu receptorów, m.in. EGFR (ang. Epidermal

Growth Factor Receptor), poprzez usztywnienie struktury biał-

ka i/lub bezpośrednie oddziaływanie [47]. Wykazano, że czą-

steczka TF zawiera sygnał dokowania w tratwach lipidowych,

jakim jest palmitylacja reszty cysteiny 245 znajdującej się w

domenie cytoplazmatycznej (Ryc. 2). Nie znany jest mecha-

nizm oddziaływania TF z cholesterolem, wiadomo natomiast,

że lokalizacja w mikrodomenach cholesterolowych sprzyja au-

toasocjacji podjednostek receptorów [3]. Według wspomnia-

nej hipotezy tratwy lipidowe miałyby stanowić rezerwuary

nieaktywnego, zdimeryzowanego TF [3,42,43]. Wyjaśniałoby

to, dlaczego krążące w krwi mikrocząstki z TF w mikrodo-

menach cholesterolowych, nie inicjują procesów krzepnięcia

[43]. Usunięcie cholesterolu z błony komórkowej wpływa na

zwiększenie właściwości prozakrzepowych TF [3,10]. Na pod-

stawie tych danych zasugerowano model, w którym forma

latentna TF występuje na terenie tratw lipidowych, natomiast

w odpowiedzi na specyficzny sygnał następuje jej uwolnienie,

oddziaływanie z fosfolipidami błony komórkowej i uaktyw-

nienie [3]. Badania przeprowadzone na fibroblastach nie po-

twierdzają jednak tego mechanizmu. Usunięcie cholesterolu z

powierzchni tych komórek zahamowało tworzenie komplek-

su TF/czynnik VII i w rezultacie nie doszło do aktywacji czyn-

nika X. Autorzy sugerują, że brak cholesterolu uniemożliwia

prawidłową asocjację i wzajemne oddziaływanie czynników

kaskady krzepnięcia [47]. Inne doniesienia wskazują z kolei,

że aktywująca TF fosfatydyloseryna jest obecna w tratwach

lipidowych [48,49]. Zmianę lokalizacji ujemnie naładowa-

nych fosfolipidów mogą kontrolować związane z tratwami

cholesterolowymi kinazy MAP. Umożliwiają one uwolnienie

jonów wapnia z siateczki endoplazmatycznej, w efekcie zaś

ekspozycję ujemnie naładowanych fosfolipidów. Hipotezę tą

potwierdzają badania przeprowadzone na komórkach ery-

troleukemicznych (HEL, ang. Human Erythroleukemia cell line).

Zostały one pozbawione cholesterolu z błony komórkowej, a

następnie były poddane działaniu jonoforu wapniowego. W

opisanych warunkach nie doszło do ujawnienia obecności PS

na powierzchni błony komórkowej i nie nastąpił napływ jo-

nów wapnia do cytoplazmy [3].

PODSUMOWANIE

TF jest białkiem, którego udział w procesach krzepnięcia

krwi znany jest od 1911 roku, czyli już od ponad stu lat. Jednak

badania przeprowadzone w ostatnim czasie doprowadziły do

obalenia szeregu utrwalonych dogmatów. Okazało się, że TF

może występować w formie nieaktywnej, a mechanizm jego

aktywacji nie został w pełni poznany. Odkryto także istnienie

dwóch izoform TF. Klasyczna, pełna forma kotwiczona jest

w błonie komórkowej, a alternatywna, krótsza postać, o nie

do końca poznanej funkcji, jest rozpuszczalna i wydzielana

przez komórki do krwi. Obie te formy są syntezowane przez

komórki śródbłonka człowieka. Najnowsze doniesienia suge-

rują, że rozpuszczalny TF bierze udział w procesach tworzenia

naczyń krwionośnych. Podwyższenie stężenia TF w osoczu

towarzyszy chorobom układu krążenia, posocznicy (sepsie),

zaburzeniom krzepnięcia krwi, jak również chorobom nowo-

tworowym. Ustalenie dokładnej roli obu izoform TF, a także

mechanizmów ich aktywacji i uwalniania przez komórki śród-

błonka jest niezwykle istotne klinicznie, m.in. ze względu na

nieustające poszukiwania markera rozwoju nowotworów.

PIŚMIENNICTWO

1. Belting M, Ahamed J, Ruf W (2005) Signaling of the tissue factor co-

agulation pathway in angiogenesis and cancer. Arterioscler Thromb

Vasc Biol 25: 1545-1550

2. Bouchard BA, Mann KG, Butenas S (2010) No evidence for tissue fac-

tor on platelets. Blood 116: 854-855

3. Bach RR (2006) Tissue factor encryption. Arterioscler Thromb Vasc

Biol 26: 456-461

4. Szotowski B, Antoniak S, Rauch U (2006) Alternatively spliced tis-

sue factor: a previously unknown piece in the puzzle of hemostasis.

Trends Cardiovasc Med 16: 177-182

5. Rao LV, Pendurthi UR (2005) Tissue factor-factor VIIa signaling. Arte-

rioscler Thromb Vasc Biol 25: 47-56

6. Banfi C, Brioschi M, Barbieri SS, Eligini S, Barcella S, Tremoli E, Colli

S, Mussoni L (2009) Mitochondrial reactive oxygen species: a common

pathway for PAR1- and PAR2-mediated tissue factor induction in hu-

man endothelial cells. J Thromb Haemost 7: 206-216

7. Banfi C, Brioschi M, Barcella S, Pignieri A, Parolari A, Biglioli P, Tre-

moli E, Mussoni L (2007) Tissue factor induction by protease-activated

receptor 1 requires intact caveolin-enriched membrane microdomains

in human endothelial cells. J Thromb Haemost 5: 2437-2444

8. Chu AJ (2005) Tissue factor mediates inflammation. Arch Biochem

Biophys 440: 123-132

9. Kasthuri RS, Taubman MB, Mackman N (2009) Role of tissue factor in

cancer. J Clin Oncol 27: 4834-4838

10. Pendurthi UR, Rao LV (2008) Role of tissue factor disulfides and lipid

rafts in signaling. Thromb Res 122 Suppl 1: S14-18

11. Owens AP, 3rd, Mackman N (2010) Tissue factor and thrombosis: The

clot starts here. Thromb Haemost 104: 432-439

12. Key NS (2008) Platelet tissue factor: how did it get there and is it im-

portant? Semin Hematol 45: S16-20

13. Muralidharan-Chari V, Clancy JW, Sedgwick A, D’Souza-Schorey C

(2010) Microvesicles: mediators of extracellular communication du-

ring cancer progression. J Cell Sci 123: 1603-1611

14. Mezzano D, Matus V, Saez CG, Pereira J, Panes O (2008) Tissue factor

storage, synthesis and function in normal and activated human plate-

lets. Thromb Res 122 Suppl 1: S31-36

15. Kothari H, Nayak RC, Rao LV, Pendurthi UR (2010) Cystine 186-cysti-

ne 209 disulfide bond is not essential for the procoagulant activity of

tissue factor or for its de-encryption. Blood 115: 4273-4283

16. Henriksson CE, Klingenberg O, Hellum M, Landsverk KS, Joo GB,

Westvik AB, Kierulf P (2007) Calcium ionophore-induced de-encryp-

tion of tissue factor in monocytes is associated with extensive cell de-

ath. Thromb Res 119: 621-630

17. Basi DL, Ross KF, Hodges JS, Herzberg MC (2003) The modulation of

tissue factor by endothelial cells during heat shock. J Biol Chem 278:

11065-11071

18. Parry GC, Mackman N (1995) Transcriptional regulation of tissue fac-

tor expression in human endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc

Biol 15: 612-621

280

www.postepybiochemii.pl

Tissue factor in endothelial cells — its structure and

function according to the current literature

Joanna Drozdowska

Medical University of Warsaw, Department of General and Nutritional Biochemistry, 61 Żwirki i Wigury St., Warsaw, Poland

e-mail: jdrozdowska@wum.edu.pl

Key words: tissue factor, TF, asTF, encrypted TF, endothelium, HUVEC

ABSTRACT

Tissue factor (TF) is a glycosylated transmembrane protein, expressed by endothelial and other cells. Its best known function is the initiation

of thrombus formation, but TF also participates in inflammation processes. This article presents the established knowledge of TF expression

in endothelial cells and current opinions on encrypted TF form and mechanisms of its activation.

19. Moll T, Czyz M, Holzmuller H, Hofer-Warbinek R, Wagner E, Winkler

H, Bach FH, Hofer E (1995) Regulation of the tissue factor promoter in

endothelial cells. Binding of NF kappa B-, AP-1-, and Sp1-like trans-

cription factors. J Biol Chem 270: 3849-3857

20. Bierhaus A, Zhang Y, Deng Y, Mackman N, Quehenberger P, Haase

M, Luther T, Muller M, Bohrer H, Greten J, et al. (1995) Mechanism

of the tumor necrosis factor alpha-mediated induction of endothelial

tissue factor. J Biol Chem 270: 26419-26432

21. Rutkowski R, Pancewicz SA, Skrzydlewska E, Hermanowska-Szpako-

wicz T (2005) Właściwości biologiczne czynnika transkrypcji jądrowej

NF-κB. Alergia Astma Immunologia 10: 125-131

22. Mackman N (1995) Regulation of the tissue factor gene. FASEB J 9:

883-889

23. Szotowski B, Antoniak S, Poller W, Schultheiss HP, Rauch U (2005)

Procoagulant soluble tissue factor is released from endothelial cells in

response to inflammatory cytokines. Circ Res 96: 1233-1239

24. Bogdanov VY, Balasubramanian V, Hathcock J, Vele O, Lieb M, Ne-

merson Y (2003) Alternatively spliced human tissue factor: a circula-

ting, soluble, thrombogenic protein. Nat Med 9: 458-462

25. Butenas S, Bouchard BA, Brummel-Ziedins KE, Parhami-Seren B,

Mann KG (2005) Tissue factor activity in whole blood. Blood 105: 2764-

26. Butenas S, Orfeo T, Mann KG (2008) Tissue factor activity and function

in blood coagulation. Thromb Res 122 Suppl 1: S42-6

27. van den Berg YW, Versteeg HH (2010) Alternatively spliced tissue fac-

tor. A crippled protein in coagulation or a key player in non-haemosta-

tic processes? Hamostaseologie 30: 144-149

28. van den Berg YW, van den Hengel LG, Myers HR, Ayachi O, Jorda-

nova E, Ruf W, Spek CA, Reitsma PH, Bogdanov VY, Versteeg HH

(2009) Alternatively spliced tissue factor induces angiogenesis through

integrin ligation. Proc Natl Acad Sci USA 106: 19497-19502

29. Hobbs JE, Zakarija A, Cundiff DL, Doll JA, Hymen E, Cornwell M,

Crawford SE, Liu N, Signaevsky M, Soff GA (2007) Alternatively spli-

ced human tissue factor promotes tumor growth and angiogenesis in a

pancreatic cancer tumor model. Thromb Res 120 Suppl 2: S13-21

30. Eisenreich A, Boltzen U, Malz R, Schultheiss HP, Rauch U (2011)

Overexpression of alternatively spliced tissue factor induces the pro-

-angiogenic properties of murine cardiomyocytic HL-1 cells. Circ J 75:

1235-1242

31. Szcześniak M, Szweykowska-Kulińska Z (2009) Regulacja alternatyw-

nego splicingu. Post Biol Kom 36: 23-35

32. Eisenreich A, Bogdanov VY, Zakrzewicz A, Pries A, Antoniak S, Poller

W, Schultheiss HP, Rauch U (2009) Cdc2-like kinases and DNA to-

poisomerase I regulate alternative splicing of tissue factor in human

endothelial cells. Circ Res 104: 589-599

33. Eisenreich A, Malz R, Pepke W, Ayral Y, Poller W, Schultheiss HP,

Rauch U (2009) Role of the phosphatidylinositol 3-kinase/protein

kinase B pathway in regulating alternative splicing of tissue factor

mRNA in human endothelial cells. Circ J 73: 1746-1752

34. Chandradas S, Deikus G, Tardos JG, Bogdanov VY (2010) Antagonistic

roles of four SR proteins in the biosynthesis of alternatively spliced

tissue factor transcripts in monocytic cells. J Leukoc Biol 87: 147-152

35. Jiang K, Patel NA, Watson JE, Apostolatos H, Kleiman E, Hanson O,

Hagiwara M, Cooper DR (2009) Akt2 regulation of Cdc2-like kinases

(Clk/Sty), serine/arginine-rich (SR) protein phosphorylation, and in-

sulin-induced alternative splicing of PKCbetaII messenger ribonucleic

acid. Endocrinology 150: 2087-2097

36. Caldwell JA, Dickhout JG, Al-Hashimi AA, Austin RC (2010) Deve-

lopment of a continuous assay for the measurement of tissue factor

procoagulant activity on intact cells. Lab Invest 90: 953-962

37. Wolberg AS, Kon RH, Monroe DM, Ezban M, Roberts HR, Hoffman

M (2000) Deencryption of cellular tissue factor is independent of its

cytoplasmic domain. Biochem Biophys Res Commun 272: 332-6

38. Wolberg AS, Monroe DM, Roberts HR, Hoffman MR (1999) Tissue

factor de-encryption: ionophore treatment induces changes in tissue

factor activity by phosphatidylserine-dependent and -independent

mechanisms. Blood Coagul Fibrinolysis 10: 201-210

39. Ahamed J, Versteeg HH, Kerver M, Chen VM, Mueller BM, Hogg PJ,

Ruf W (2006) Disulfide isomerization switches tissue factor from co-

agulation to cell signaling. Proc Natl Acad Sci USA 103: 13932-13937

40. Manukyan D, von Bruehl ML, Massberg S, Engelmann B (2008) Pro-

tein disulfide isomerase as a trigger for tissue factor-dependent fibrin

generation. Thromb Res 122 Suppl 1: S19-22

41. Pendurthi UR, Ghosh S, Mandal SK, Rao LV (2007) Tissue factor ac-

tivation: is disulfide bond switching a regulatory mechanism? Blood

110: 3900-3908

42. Popescu NI, Lupu C, Lupu F (2010) Extracellular protein disulfide iso-

merase regulates coagulation on endothelial cells through modulation

of phosphatidylserine exposure. Blood 116: 993-1001

43. Del Conde I, Shrimpton CN, Thiagarajan P, Lopez JA (2005) Tissue-

-factor-bearing microvesicles arise from lipid rafts and fuse with acti-

vated platelets to initiate coagulation. Blood 106: 1604-1611

44. Versteeg HH, Ruf W (2007) Tissue factor coagulant function is enhan-

ced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase ac-

tivity. J Biol Chem 282: 25416-25424

45. Bilska A, Kryczyk A, Włodek L (2007) Różne oblicza biologicznej roli

glutationu. Postepy Hig Med Dośw 61: 438-453

46. Bach RR, Monroe D (2009) What is wrong with the allosteric disulfide

bond hypothesis? Arterioscler Thromb Vasc Biol 29: 1997-1998

47. Mandal SK, Iakhiaev A, Pendurthi UR, Rao LV (2005) Acute chole-

sterol depletion impairs functional expression of tissue factor in fibro-

blasts: modulation of tissue factor activity by membrane cholesterol.

Blood 105: 153-160

48. Clark MR (2011) Flippin’ lipids. Nat Immunol 12: 373-375
49. Ishii H, Mori T, Shiratsuchi A, Nakai Y, Shimada Y, Ohno-Iwashita Y,

Nakanishi Y (2005) Distinct localization of lipid rafts and externalized

phosphatidylserine at the surface of apoptotic cells. Biochem Biophys

Res Commun 327: 94-99