Immunologia – wykład 4 30.10.2013

Temat: Limfocyty regulatorowe: fakty znane i nieznane

Komórki macierzyste szpiku kostnego są odpowiedzialne za powstawanie wszystkich rodzajów krwinek.

Krążenie limfocytów:

 Limfocyty stale krążą między krwią a narządami limfatycznymi

 80% limfocytów dostaje się do węzłów chłonnych przez wyspecjalizowane tzw. Żyłki o wysokim śródbłonku

(HEV – high endothelial velunes)

 Pozostałe limfocyty dostają się do węzłów chłonnych doprowadzającymi naczyniami limfatycznymi razem z

komórkami dendrytycznymi i antygenami

 Limfocyty opuszczają węzły chłonne odprowadzającymi naczyniami chłonnymi

 Krążenie limfocytów pozwala im spotkać znane im antygeny, a także inne subpopulacje tych komórek, co pozwala

im indukować skuteczną odpowiedź immunologiczną

Klasyfikacja CD

 Oparta na identyfikacji pojedynczych epitopów przy użyciu przeciwciał monoklonalnych

 CD to przede wszystkim antygeny różnicowania komórek i ich receptorów

 Inne markery CD to: różne białka, enzymy, kompleksy lipidowe, cząsteczki adhezji itd.

 Większość ale nie wszystkie CD występują na powierzchni komórek

 Markery CD dotyczą przede wszystkim komórek hemopoetycznych

 Aktualnie CD to około 250 markerów

Markery i rodzaje limfocytów B

1.  Markery CD: CD19, CD20, CD21, CD22, CD35, CD40, CD72, CD80, CD86
2.  Limfocyty B1: B1a (CD5+) I B1b (CD5-)
3.  Limfocyty B1 stanowią około 20% limfocytów B we krwi obwodowej i śledzionie u zdrowych ludzi – wydzielają

tylko IgM

4. Limfocyty B2: stanowią większość immunokompetentnych komórek B

Przekazywanie sygnałów w aktywacji limfocytu B

1.  Kinazy tyrozynowe Ick, Iyn, fyn są aktywowane via Igα i Igβ receptora limfocytów B
2.  Powodują fosforylację domen BCR i ITAM
3.  Mogą wtedy przyłączyć Syk, inną kinazę, która aktywuje fosfolipazę C (PLC-γ)
4.  PLC i trzy inne drogi aktywacji (Ras, RhO, PI-3K) prowadzą do indukcji czynników transkrypcyjnych takich jak:

NF-AT, AP-1 i NF – kappa B

Przykłady markerów CD

Nazwa zwyczajowa

Występowanie

CD3

Kompleks przekazywania
sygnałów TCR

Limfocyty T

CD4

Receptor MHC klasy II

Limfocyty T

CD8

Receptor MHC klasy I

Limfocyty T

CD10

Obojętna endopeptydaza

Komórki ALL

CD19

Podjednostka co – recept.

Limfocyty B

CD45

LCA (fosfataza tyrozynowa)

Leukocyty

CD62L

L – selektyna

Limfocyty T, monocyty i
granulocyty

CD247

Łańcuch zeta TCR

Limfocyty T i komórki NK

Limfocyty T regulatorowe (supresorowe) Treg

1.  Limfocyty Th2 – wydzielają IL-4
2.  Limfocyty Th3 – wydzielają TGF-beta
3.  Tr1 cells – wydzielają IL-10
4.  Limfocyty T CD4+, CD25+, Foxp3
5.  Limfocyty T CD8+, CD28-
6.  Niektóre cytotoksyczne limfocyty T
7.  Niektóre limfocyty gamma/delta
8.  Limfocyty NKT

Limfocyty T cytotoksyczne Tcyt

1.  Limfocyty T alpha/beta CD8+
2.  Limfocyty Th1 alpha/beta CD4+
3.  Limfocyty T gamma/delta (CD3+, CD4-, CD8-, CD16+)
4.  Komórki NKT (NT) (CD3+, CD4-, CD8-)
5.  Komórki NK (CD2+, CD3-, CD4-, CD8-, CD16+)

Cechy komórek NK

1.  Należą do tzw. dużych limfocytów ziarnistych (LGL – large granular lymphocytes)
2.  Stanowią około 10% limfocytów krwi obwodowej
3.  Wykazują spontaniczną cytotoksyczność przeciw komórkom zakażonym i nowotworowym
4.  Ich cytotoksyczność jest hamowana przez konwencjonalną ekspresję antygenów MHC na komórkach docelowych
5.  U osób z podwyższoną liczbą komórek NK – przypadki nowotworów są rzadsze

Limfocyty Th1 i Th2 CD4+ - profil wytwarzanych cytokin

Th1
- IL-2
- IFN-gamma
- LT

Th2
-IL4
-IL5
-IL6
-IL10
-IL13

Treg – 17

 Wytwarzają IL-17A, IL-17F (cytokiny te są odpowiedzialne za indukcję, wytwarzanie cytokin prozapalnych,

chemokin i metaloproteinaz w wielu tkankach oraz komórkach co w rezultacie wspomaga rekrutację neutrofilii do
tkanek

 IL-21

 IL-22

 Za ich podstawową funkcję uważa się niszczenie poza komórkowych patogenów, które nie zostały zniszczone

przez Th1 lub Th2

Limfocyty CD4+ (nTreg, iTreg) profil wytwarzanych cytokin

nTreg CD4+ CD25+

iTreg (indukowane, adaptatywne)

5-10% komórek krwi obwodowej

Nowa subpopulacja Treg, której rola nie jest
jasna

Hamują proliferację CD4+ CD8+

Wiadomo, że są wytwarzane po indukcji z
odczynnikiem zewnętrznym

Specyficzny marker FOXP3, mniejsze
wydzielanie IL-2, IFN-γ

Mutacja FOXP3

 Dysregulacja odpowiedzi immunologicznej, poliendokrynopatie, enteropatie sprzężone z chromosomem X

 Prawdopodobnie odpowiada za system odpowiedzi autoimmunologicznej w pierwszym roku życia

Aktywacja limfocytów

 Kompleks TCR w limfocytach T, kompleks BCR w limfocytach B, mogą przekazywać sygnały do wnętrza

komórek

 W TCR funkcję tą spełnia CD3 łańcuchy zeta oraz kinaza tyrozynowa p56

 W BCR są to cząsteczki Igα i Igβ mające również łańcuchy zeta.

 W obrębie zeta są motywy aktywacji immunoreceptora tyrozyny (ITAM), które aktywują kolejne kinazy (ZAP-70 i

Syk odpowiednio)

Wewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnału w procesie aktywacji limfocytów T

 Obejmuje transdukcję sygnałów z TCR i CD28

 CD4 wiąże kinazy Ick aktywując się

 Domeny ITAM CD3 ulegają fosforylacji przez Ick

 ITAMs wiążą się z innymi kinazami takimi jak ZAP-70 i fyn

 Fyn aktywują fosfolipazę C co powoduje uwolnienie wewnątrzkomórkowego wapnia

 Wapń wiąże się z kalcyneuryną i aktywuje czynniki transkrypcyjne (NF-AT, NF-kappa B, AP-1)

Interakcje pomiędzy leukocytami a śródbłonkiem

 Leukocyty wchodzą w interakcje ze ścianami naczyń wieloetapowo przy użyciu cząsteczek powierzchniowych,

które rozpoznają ich odpowiednie receptory na komórkach śródbłonka

 Toczenie się i związanie leukocytów ze ścianą naczyń zachodzi dzięki selektynom

 Chemokiny i ich receptory są potrzebne do aktywacji integryny leukocytów

 Tylko aktywowane integryny są w stanie zapewnić prawidłową adhezję pomiędzy leukocytami a śródbłonkiem

 Migracja leukocytów do tkanek wymaga proteinaz i mechanizmów naprawczych

Temat: Melanocyty – komórki immunologicznie kompetentne

Melanocyty, komórki barwnikowe zawierające melaninę opisane po raz pierwszy na początki XIX wieku.

Przez wiele lat sądzono, że ich jedyną funkcją w organizmie jest synteza i dystrybucja melaniny, która głównie chroni
skórę przed szkodliwym wpływem promieniowania UV. Przypuszczenia te jednak komplikował fakt, że melaninę
zidentyfikowano nie tylko w skórze i oku, ale również w obszarach nieeksponowanych na światło np. w mózgu i uchu
wewnętrznym

Melanocyty znajdują się pod ścisłą kontrolą keratynocytów. W odpowiedzi na promieniowanie UV, keratynocyty
wydzielają substancje, które regulują proliferację, różnicowanie oraz ruchliwość melanocytów. Powoduje to wytworzenie
barwy skóry, komórki w ten sposób chronią skórę przed promieniowaniem UV.

Synteza melaniny odbywa się przy udziale tyrozynazy.

Melanocyty mają zdolność do wytwarzania wielu różnorodnych cząsteczek sygnalizowanych, których uwalnianie nasila się
w wyniku działania czynników stresogennych (np. uraz, UV, toksyny bakteryjne). Wykazują również ekspresję antygenów
charakterystycznych dla komórek efektorowych odpowiedzi immunologicznej a reakcje immunologiczne toczące się w
skórze, w szczególności te o podłożu zapalnym, wpływają znacząco na funkcję melanocytów, co uwidacznia się w postaci
odbarwień lub przebarwień.

Zdolność melanocytów do wydzielania neuropeptydów oraz ich bliskie sąsiedztwo anatomiczne z zakończeniami
nerwowymi skóry wykazują na Melanocyty jako komórki neuroendokrynne. Sformułowano nawet hipotezę, że melanocyty
są elementami łączącymi skórę z centralnym układem nerwowym.

Rola melanocytów w inicjacji procesu zapalnego

Mimo, iż w zapoczątkowaniu reakcji immunologicznej biorą udział przede wszystkim klasyczne komórki prezentujące
antygen, również melanocyty mogą uczestniczyć w komórkowych reakcjach cytotoksycznych zależnych od przeciwciał,
prezentujące antygeny limfocytom T.

Melanocyty zaangażowanie w proces zapalny komunikują się z innymi komórkami skóry za pośrednictwem N- i E-
kadheryny, demogleiny, koneksyny, endoteliny 1, czynnika stymulującego kolonie granolocytarno – makrofagowe (GM –
CSF), czynnika wzrostu komórek pnia (SCF), czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) oraz tlenku azotu (NO)

Interakcja z limfocytami T, skutkujące pobudzeniem zarówno limfocytów jak i melanocytów wynika m.in. z ekspresji na
powierzchni melanocytów cząsteczek adhezyjnych ICAM-1 (cząsteczki adhezji międzykomórkowej – ICAM) i VCAM-1
(cząsteczka adhezji komórkowej naczyń – VCAM) oraz cząsteczek CD40. Zaobserwowano że ekspresja wymienionych
cząsteczek zwiększa się w wyniku działania interferonu INF-γ i/lub czynnika martwicy nowotworów (TNF), które
stymulują również melanocyty do produkcji fibronektyny – białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Ponadto inne białko –
atraktyna – proteina szybko uwalniana przez aktywne limfocyty T – wzmaga produkcję melanokortyny α – MSH,
neuropeptydu o działaniu melanotropowym. α – MSH oddziałując z obecnymi na powierzchni melanocytów receptorami
dla melanokortyny stymuluje aktywność tyrozynazy – kluczowego enzymu melanogenezy.

Melanocyty są zdolne do fagocytozy patogenów. Na ich powierzchni wykryto ekspresję receptorów dla fragmentu Fc
przeciwciał klasy IgG, które odpowiadają m.in. za indukowane fagocytozy.

Natomiast melanosomy – organelle zawierające melaninę – uczestniczą w szlaku lizosomalnej degradacji i przetwarzania
antygenów dzięki obecności charakterystycznych dla lizosomów pomp protonowych oraz enzymów np., fosfatazy kwaśnej,
β – galaktozydazy, lipazy, mannozydazy i N – acetylo – β – glukozaminidazy.

Cząsteczki sygnalizacyjne wydzielane przez melanocyty

Pobudzone melanocyty skórne są zdolne do produkcji i sekrecji różnorodnych cząsteczek sygnalizacyjnych. Uwalniają
cytokiny zapalenia (IL - 1α, IL – 2, IL – 3, IL – 6, IL – 10 i TNF – α), czynniki chemotaktyczne (IL – 8, aktywujący i
chemotaktyczny czynnik monocytów – MCAF) oraz transformujący czynnik wzrostu TGF – β1. Syntetyzują również
katecholaminy, Eikozanoidy, serotoninę, α – MSH oraz tlenek azotu (NO).

Komórkami docelowymi dla produktów sekrecji melanocytów są keratynocyty, limfocyty, fibroblasty, komórki tuczne,
dendrytyczne oraz komórki śródbłonka i w tym aspekcie melanocyty działają jako ważne miejscowe regulatory ich
aktywności.

Melanocyty są również podatne na działanie wielu cząsteczek sygnalizacyjnych w tym cytokin zapalenia. Na ich
powierzchni stwierdzono obecność receptorów dla IL – 1, IL – 6, TNF – α, IFN – γ, epidermalnego czynnika wzrostu
(EGF), zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), czynnika wzrostu nerwów (NGF) i TGF, przy czym jedynie
dla receptorów IL – 6 – IR i TNF – α wykazana konstytutywną transkrypcję odpowiadającego im RNA. Melanocyty
wykazują także ekspresję receptorów dla histaminy, prostaglandyn i leukotrienów.

Cytokiny charakteryzują się aktywnością plejotropową i mogą wywoływać różne skutki biologiczne. Prawdopodobną
konsekwencją wrażliwości melanocytów na ich autokrynowe lub parakrynowe działanie są zaburzenia barwnikowe skóry.

Nieznany jest także mechanizm działania cytokin na melanocyty. Przypuszcza się, że uczestniczy w nim cykliczny AMP,
ważny regulator proliferacji melanocytów i procesu melanogenezy. Pod uwagę bierze się także mediację za pośrednictwem
prostaglandyn.

Do czynników pobudzających wzrost melanocytów należą bFGF, HGF oraz czynnik wzrostu mastocytów (MGF).
Natomiast inhibitorami proliferacji są IL – 1, IL – 6, TNF – α, IFN – β i TGF – β. Cytokiny modulują nie tylko wzrost
prawidłowych melanocytów ale również komórek zmienionych nowotworowo (czerniak). Transformacja nowotworowa
wzmaga na ich powierzchni ekspresję receptorów dla IL – 1, IL – 6 oraz TNF – α a wraz z progresją zmiany na komórkach
pojawiają się receptory dla TGF – β i GM – CSF. Wykazano, że w tym przypadku efekt działania cytokin uwarunkowany

jest stopniem rozwoju nowotworu. We wczesnych stadiach wzrostu IL – 8 i TNF – α działają jako inhibitory proliferacji,
jednak wraz z progresją nowotworu w zaawansowanej, przerzutowej fazie stają się autokrynnymi czynnikami wzrostu.

TNF – α jest niezwykle ważną cytokiną uwalnianą przez melanocyty i wpływającą na funkcję tych komórek. TNF – α
odgrywający podstawową rolę w odporności przeciwnowotworowej pobudza prawidłowe melanocyty do proliferacji,
natomiast hamuje proliferację komórek czerniaka. Czynnik ten może zwiększać tempo apoptozy zarówno komórek
prawidłowych jak i zmienionych nowotworowo. Indukuje również wydzielanie IL – 8 i MCAP. Wpływ TNF – α na
melanocyt wiąże się nie tylko z działaniem parakrynowym, ale również autokrynowym. In vitro zaobserwowano, że
komórki melanotyczne wydzielały TNF – α w ilościach kilkakrotnie wyższych niż komórki amelanotyczne a α – MSH
hamował sekrecję tego czynnika przez melanocyty.

Innym ważnym aspektem udziału melanocytów w reakcjach zapalnych jest ich zdolność do produkcji NO. Zdolność tę
wykazują również inne komórki układu SIS, w których w odpowiedzi na działanie bodźców stresogennych, i w dużej
mierze za pośrednictwem cytokin, dochodzi do aktywacji indukowanej syntazy tlenku azotu (iNOS) a w konsekwencji
wzmożonej produkcji i sekrecji NO. Wśród czynników stymulujących ekspresję iNOS najczęściej wymienia się IFN – γ,
liposacharyd LPS oraz TNF – α. Wymienione stymulatory są również zdolne do indukcji syntezy NO w ludzkich
melanocytach in vitro. Zjawiska tego nie obserwuje się w komórkach czerniaka jednak mimo braku reakcji na działanie
cytokin i LPS – wykazują one niewielką ekspresję iNOS.

Wymienione czynniki wyzwalają kaskadę reakcji nasilających aktywność tyrozynazy, a wzmożonej melanogenezie
towarzyszy wzrost transferu melanosomów do keratynocytów. Przebieg tych procesów modulują cytokiny wydzielane
przez keratynocyty i melanocyty. Promieniowanie UVB pobudza syntezę endoteliny 1 (ET – 1) w komórkach naskórka, co
dodatkowo stymuluje biosyntezę melaniny.

Mimo niezaprzeczalnego wpływu reakcji immunologicznych na fizjologię melanocytu, mało wiadomo o bezpośrednim
udziale melaniny w procesach odpornościowych. Postuluje się zdolność melaniny do neutralizowania toksyn bakteryjnych,
hamowanie proliferacji mikroorganizmów i aktywności przeciwwirusowej np. wobec ludzkiego wirusa niedoboru
odporności (HIV). W ostatnich latach pojawiły się doniesienia o wpływie melaniny na syntezę cytokin zapalenia.

Wykazano, że egzogenna melanina hamowała sekrecję IL – 1, IL – 6 i IL – 10 oraz TNF – α przez stymulowane monocyty
krwi obwodowej oraz obniżała produkcję IL – 6 w pobudzonych komórkach śródbłonka naczyń i fibroblastach.
Dowiedziano również, że neuromelanina może stymulować komórki mikrogleju i indukować powstanie cząsteczek o
właściwościach prozapalnych, przyczyniając się do rozwoju przewlekłego zapalenia, będącego jednym z objawów
choroby. Melanina może także indukować stan zapalny w błonie naczyniowej oka.

Immunomodulacyjne właściwości ludzkich melanin nie są wyjątkowe w świecie organizmów żywych. U bezkręgowców
melanogeneza odgrywa ważną rolę w obronie przed pasożytami i innymi patogenami. Wykazano także, że melanina
wyizolowana z winogron modyfikowana reakcję zapalną u ludzi poprzez oddziaływanie z prostaglandynami i
leukotrienami, natomiast melanina grzybów aktywowała układ dopełniacza.