Immunologia 

– prelekcja 5.11.2007 

 

Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników. 

 

Służą one oznaczaniu substancji o charakterze białkowym w płynach ustrojowych. 

Poszukiwany związek może być zarówno przeciwciałem jak i antygenem. Ogólna zasada wszystkich 
metod polega na tym, że jeden ze składników kompleksu Ag-Ab wyznakowany jest znacznikiem 
(markerem). Rodzaj tego znacznika dzieli metody na: 



  Fluorymetryczne – znacznikiem jest fluorochrom – barwnik fluoryzujący w świetle o krótkiej 

fali (zielony, żółty, czerwony) 



  Radioimmunometryczne (RIA) – znacznikiem jest pierwiastek promieniotwórczy 



  Immunoenzymatyczne (EIA) – znacznikiem jest enzym 



  Chemiluminescenscyjne – znacznikami są określone substancje organiczne 

 

Metody fluorymetryczne 

 
Barwnikami są: 



  Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) – reaguje na światło zielone 



  Izotiocyjanian rodaminy B (RITC) – reaguje na światło czerwone 

 
Emisję wzbudza wiązka światła o małej długości fali, aby ją uzyskać stosujemy: 



 

Filtry przepuszczające promieniowanie indukujące fluorescencję 



 

Filtry usuwające promieniowanie niepożądane 

 
Metoda bezpośrednia 
 

Jeden ze składników kompleksu (antygen) jest związany z fazą stałą (tkanki, komórki, 

powierzchnia płytki polistyrenowej, kulki poliakrylamidowe), stanowi materiał poszukiwany. 
Dodajemy znakowane przeciwciało swoiste dla antygenu doprowadzając do wytworzenia kompleksu 
Ag + AbF*, o czym mierzymy fluorescencję tego kompleksu. 

 

 
Metody pośrednie 
 
Antygen związany jest z fazą stałą, poszukujemy przeciwciała. Najpierw dodajemy do mieszaniny 
reakcyjnej badanego materiału, a potem znakowanego przeciwciała antyglobulinowego skierowanego 
przeciw poszukiwanemu przeciwciału. Zalety metod pośrednich to: 



 

Większa czułość i swoistość w porównaniu do metod pośrednich 



 

Uniknięcie możliwości zmian swoistości przeciwciała podczas znakowania 

 

 
Odmianą metod pośrednich są tzw. metody „kanapkowe” (ang. „sandwich”), w których oznaczany 
materiał jest antygenem. Do związanego z fazą stałą przeciwciała dodajemy badanego materiału, po 
czym inkubujemy próbkę i dodajemy znakowanych przeciwciał przeciwko poszukiwanej substancji. 
Nadmiar znakowanych przeciwciał odpłukujemy po czym oceniamy fluorescencję kompleksów Ab-
Ag_Ab* związanych z fazą stałą. 
 

 

 

Metody radioimmunologiczne (RIA) 

 

Polegają one na wykrywaniu reakcji Ag- swoiste Ab poprzez pomiar promieniowania 

izotopów promieniotwórczych związanych z jednym ze składników kompleksu. Najczęściej 
stosowane znaczniki to izotop 

125

J i tryt 

3

H. 

 
Metoda kompetycyjna  
 
Przebiega w dwóch etapach: 



  W pierwszym wyznakowany izotopem antygen łączy się z dodanym w niedoborze wolnym 

przeciwciałem w kompleksy Ab-Ag* które odpłukujemy i mierzymy radioaktywność 
mieszaniny reakcyjnej, proporcjonalną do ilości nie związanego znakowanego antygenu w 
roztworze. 



  W drugim etapie do badanego materiału (z badanym Ag) dodajemy takie same ilości 

znakowanego Ag* oraz przeciwciała (w niedoborze). Zachodzi konkurencja o przeciwciało 
pomiędzy Ag i Ag*, a stosunek kompleksów Ab-Ag do Ab-Ag* zależy od ilości Ag w 
badanym materiale. Im jest go więcej tym więcej „odbiera” on przeciwciała Ag*, które po 
odpłukaniu kompleksów immunologicznych pozostaje w roztworze w większej ilości niż w 
pierwszym etapie, wzmagając jego radioaktywność. Stężenie badanego Ag oceniamy poprzez 
pomiar radioaktywności supernatantu mieszaniny reakcyjnej i odnosząc wynik do uzyskanego 
w pierwszym etapie. Im więcej badanego antygenu tym zwiększa się radioaktywność 
supernatantu w drugim etapie reakcji. 

 

Metoda immunoradiometryczna 
 

Jeden ze składników reakcji związany jest z fazą stałą. Może to być plastikowa próbówka 

bądź mikropłytka którą opłaszczamy nie znakowanymi przeciwciałami, po czym dodajemy badanego 
materiału (poszukujemy antygenu), a po inkubacji – znakowanego przeciwciała, uzyskanego przez 
immunizację innego gatunku ludzkim poszukiwanym antygenem i inkubujemy ponownie. Nadmiar 
nie związanych przeciwciał odpłukujemy, po czym mierzymy radioaktywność na płytce bądź w 
próbówce. 
 
Zastosowanie metod RIA 
 



 

Ilościowe oznaczanie antygenów lub przeciwciał 



 

Oznaczanie stężenia hormonów w płynach ustrojowych 



 

Wykrywanie obecności białek towarzyszących nowotworom (np. antygenu rakowo-
płodowego i alfa-fetoproteiny) 



 

Oznaczanie ilości swoistych przeciwciał klasy IgE w alergiach 



 

Oznaczanie stężenia witamin i leków 



 

Wykrywanie obecności autoprzeciwciał  w schorzeniach autoimmunologicznych 

 
W oparciu o techniki immunoradiometryczne opracowano dwa testy do oznaczania poziomu IgE o 
danej swoistości w surowicy , oraz poziomu IgE w alergologii: 



  RAST (RadioAlergoSorbent Test) 



  RIST (RadioImmunoSorbent Test) 

 

Metody immunoenzymatyczne (EIA) 

 

Znacznikiem jednego ze składników reakcji jest enzym. Produkt reakcji katalizowanej przez 

enzym jest barwnym a oznaczamy go metodami spektrofotometrycznymi. Metody te charakteryzują 
się wysoką czułością oraz brakiem konieczności stosowania pierwiastków promieniotwórczych co 
daje im przewagę nad metodami RIA. 
Stosowane enzymy muszą spełniać takie warunki jak: 



 

Rozpuszczalność 



 

Stabilność 



 

Łatwe i trwałe wiązanie się z białkiem 



 

Nieobecność (lub występowanie w śladowych ilościach) w płynach ustrojowych 



 

Łatwo dostępne substraty 



  Barwne produkty reakcji 

Najczęściej stosujemy: 



 

Peroksydazę chrzanową (HRP) 



 

Fosfatazę alkaliczną (AP) 



 

Oksydazę glukozową (GO) 

Substratami dla enzymów są H

2

O

2

 i związek chromogenny, dające w efekcie działania 

enzymu zmianę zabarwienia. 
Najczęściej stosowane chromogeny to: 



  Ortofenylodiamina (OPD) 



  Orto-dwuanizydyna 



  Kwas 5-aminosalicylowy (PAS) 



  P-nitrofenylofosforan sodowy 

 
Metoda EIA pośrednia 
 
Jest to metoda w której poszukujemy antygenu.  
Reakcja przebiega w kilku etapach: 



 

Połączenie poszukiwanego Ag ze swoistym przeciwciałem, inkubacja, płukanie 



 

Dodanie przeciwciała antyglobulinowego przeciwko Ab znakowanego enzymem, 
inkubacja, płukanie 



  Dodanie H

2

O

2

 i chromogenu, reakcja barwna 

Metoda ta ma różne modyfikacje. Najczęściej są to reakcje trójstopniowe, co zwiększa 
czułość metody. Dzięki EIA możemy także oznaczać przeciwciała, w tym celu 
wykorzystujemy odpowiednie antygeny związane np. ze ściankami próbówki bądź 
mikropłytką. 
 
Test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 
 
Zastosowanie testu: 



 

Wykrywanie obecności w płynach biologicznych antygenów i przeciwciał w 
chorobach zakaźnych i pasożytniczych 



 

Ocena ilościowego stężenia hormonów 



 

Wykrywanie obecności autoantygenów. 

 

Metody chemiluminescencyjne 

 
 

Są oparte na pomiarze emisji fotonów w przebiegu reakcji chemicznej. Jeden z 

reagentów oznakowany jest substancją organiczną – lucyferyną lub estrem akrydyny. W 
przebiegu znacznikowej reakcji chemicznej zachodzi emisja promieniowania w zakresie 
światła widzialnego, które mierzymy za pomocą luminometru. Emisja fotonów trwająca kilka 
sekund przetwarzana jest na liczbę impulsów na minutę. Technika ta stosowana jest do 
ilościowego pomiaru tak antygenu jak i przeciwciała. 
 

Metody immunomorfologiczne (IF) 

 
Dzielą się one na: 



  Metody immunofluorescencyjne – znacznikiem są flurorchromy 



  Metody immunoenzymatyczne – znacznikiem są enzymy 



 

Z użyciem metali szlachetnych jako znacznika – wykorzystujemy np. roztwór 
koloidalny złota otrzymywany z kwasu chlorozłotawego za pomocą reduktorów 
(aldehyd mrówkowy, kwasy organiczne) 

 
Materiał do badań stanowią: 



  Wycinki tkanek (bioptaty) 



 

Zawiesina żywych komórek (krew) 



 

Zawiesina żywych bakterii 

Preparaty ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym.  
 
Metoda immunomorfologiczna bezpośrednia 
 

Znakowane jest przeciwciało, poszukujemy antygenu w badanym materiale, np. 

wykrywanie antygenu Chlamydia trachomatis w wymazach z kanału szyjki macicy.  

 

Metoda immunomorfologiczna bezpośrednia 
 
Przebiega w dwóch etapach: 



  Inkubacja poszukiwanych nieznakowanych przeciwciał swoistych z antygenami 



 

Identyfikacja utworzonych kompleksów po dodaniu znakowanych przeciwciał 
antyglobulinowych 

 

 
Jest to metoda czulsza od IF pośredniej. 
 
Dwubarwna reakcja immunofluorescencji 
 
Wykorzystujemy dwa fluorochromy emitujące światło o różnych barwach, co pozwala nam 
na ocenę w preparacie dwóch różnych antygenów. Reakcja przebiega w kilku etapach: 



 

Badany materiał inkubujemy ze znakowanymi przeciwciałami swoistymi dla 
pierwszego antygenu (np. p/ciała przeciw białku SpoIIAB znakowane FITC, dającym 
kolor zielony) 



 

Następnie inkubujemy próbkę ze znakowanymi przeciwciałami swoistymi dla 
drugiego antygenu (np. anty DNA znakowane RITC, dającym kolor czerwony) 

Wynikiem reakcji jest dwukolorowy preparat oceniany w mikroskopie fluorescencyjnym. 
Zastosowanie – np. wykrywanie komórek Baccillus subtilis przekształcających się w 
przetrwalniki. 
 
Technologia BIOCHIP 
 

Wycinki tkanek, hodowle komórek lub rozmazy bakterii są umieszczane na 

cieniutkich płytkach szklanych, które są dzielone na milimetrowej wielkości fragmenty 
(BIOCHIPy), które są przyklejane automatycznie do szkiełek mikroskopowych. Technologię 
tą można wykorzystać do wykrywania w jednej próbce przeciwciał przeciwko kilku 
antygenom. 
Metoda ta znalazła zastosowanie w diagnostyce infekcji układu oddechowego tak 
bakteryjnych: 



  Botredella pertussis i parapertussis 



  Haemophilus influenzae 



  Leginonella pneumoniae 



  Klebsiella pneumoniae 



  Chlamydia trachomatis 



  Chlamydophila pneumoniae 

Jak i wirusowych: 



  Herpes simplex virus 1 



  Wirusy oddechowe 



  Adenovirus 



  Influenza A i B virus 



  Parainfluenza virus 1-4 



  Coxsackie (A7, A9, A16, A24, B1 do B6) 

 
Metody immunomorfologiczne immunoenzymatyczne (EIA) 
 
 

Analogicznie do w/w testów immunoenzymatycznych, w metodach tych do 

znakowania przeciwciał stosuje się enzymy katalizujące reakcje dające barwne produkty. 
Detekcji kompleksów dokonuje się za pomocą metod immunohistochemicznych. Są to 
metody jakościowe. Stosowane enzymy muszą spełniać takie same kryteria jak w przypadku 
testów immunoenzymatycznych, stąd też w metodach tych najczęściej stosuje się wyżej 
wymienione enzymy (peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, oksydazę glukozową), 
natomiast stosowane chromogeny to: 



  Tetrachlorowodorek 3,3-dwuaminobenzydyny (DAB) – daje ciemnobrązowy produkt 

nierozpuszczalny w wodzie.  



  3-amino-9-etylokarbazol (AEC) – daje czerwony produkt nierozpuszczalny w wodzie, 

rozpuszczalny w alkoholu. 

 
Reakcja peroksydaza-antyperoksydaza (PAP) 
 
Składa się z dwóch etapów: 



 

W pierwszym etapie wykrywamy antygen swoistym przeciwciałem 



  W drugim etapie dodajemy p/ciał znakowanych enzymem peroksydaza-

antyperoksydaza związanych za pomocą mostka – wiążą się one z kompleksem Ab-
Ag poprzez warstwę pośrednią nieznakowanych p/ciał reagujących z przeciwciałem 
pierwotnym oraz kompleksem enzym-antyenzym 



  W trzecim etapie dodajemy H

2

O

2

 i związek chromogenny 



  W czwartym etapie odczytujemy wynik reakcji – obecność poszukiwanego antygenu 

oceniamy na podstawie wyniku badanej reakcji – obecności lub braku brązowego (lub 
innego koloru) barwnika (zależy od chromogenu). 

 

 

 

Zastosowanie metody to wykrywanie markerów nowotworowych w tkankach: 
 

Typ nowotworu 

Marker wykrywany immunoenzymatycznie 

Mięsak gładkokomórkowy okrężnicy 

Przeciwciała przeciwaktynowe 

Łagodny przerost gruczołu krokowego 

Receptory androgenowe 

Rak przewodów żółciowych 

Receptory Bcl-X 

Chłoniak pochodzący z limf. T 

CD3 

Chłoniak Hodgkin’a 

CD15 

Rakowiak (nowotwór okresu płodowego) 

Chromogranina A 

Chłoniak 

CPP32 

Złośliwy międzybłoniak pochodzący z 
nowotworu błony surowiczej 

Cytokeratyna 5/6 

Rak piersi 

Receptor estrogenowy 

Czerniak złośliwy 

Kompleksy melaniny A 

 
Reakcja fosfataza alkaliczna – antyfosfataza alkaliczna (APAAP) 
 
 

Zasada metody jest podobna do reakcji PAP, różni się jedynie wykorzystywanym 

kompleksem. Zastosowanie metody jest bardzo podobne, służy ona do wykrywania obecności 
antygenów w tkankach. Barwne, czerwone produkty reakcji są dobrze widoczne w 
mikroskopie świetlnym. 
 

 

 
Zastosowanie metody: 
 

Typ nowotworu 

Marker wykrywany immunoenzymatycznie 

Anaplasyczny chłoniak olbrzymiokomórkowy 

CD30 

Łuskowaty rak skóry 

Nabłonkowy cz. wzrostu EGFR 

Chłoniak obwodowy wyw. z limfocytów T 

Granzym B 

 
 
 
 

Reakcje z układem biotyna-awidyna 
 
 

W metodzie tej wykorzystuje się wysokie powinowactwo biotyny (nisko 

cząsteczkowej wit. H) do zasadowej glikoproteiny białka jaja kurzego – awidyny. Czasem 
zamiast awidyny wykorzystuje się streptawidynę, izolowaną z bakterii Streptomyces avidini. 
 

 

 

 

Cytometria przepływowa 

 

Jest to nowoczesna metoda badawcza służąca do wieloparametrowej oceny komórek układu 

krwiotwórczego. Pozwala ona na jednoczesne określenie: 



 

Komórek krwi na podstawie ich wielkości i granularności (populacje erytrocytów, 
granulocytów, limfocytów, monocytów i trombocytów) 



 

Różnych rodzajów antygenów różnicowania (CD) i innych poprzez użycie przeciwciał 
monoklonalnych znakowanych różnymi fluorochromami. 

Warunkiem wykonania analizy cytometrycznej jest doprowadzenie posiadanego materiału do 
zawiesiny pojedynczych komórek. Przy pobieraniu krwi do badań cytometrycznych stosujemy 
odpowiedni antykoagulant: 



  EDTA i heparyna – dla pełnej krwi 



  Hirudyna – dla szpiku kostnego 

W uzyskanej zawiesinie komórek należy określić ich żywotność. Po dokonaniu analizy można 
komórki sortować na poszczególne frakcje stosując odpowiednie urządzenie pomiarowe, tzw. sorter 
komórek. 
 
 

Zasada metody polega na tym, że komórki kierowane są do kanału w strumieniu cieczy 

pojedynczo, po czym wiązka niebieskiego bądź ultrafioletowego światła oświetla przepływające 
komórki, ulegając ugięciu i rozproszeniu, a jeśli komórki zostały wyznakowane znacznikiem 
fluorescencyjnym, także wzbudzając fluorescencję. Źródłem światła są lasery lub rtęciowe lampy 
wysokociśnieniowe. Światło ugięte i rozproszone, a także fluorescencyjne zbierane jest przez 
odpowiednio dopasowany układ optyczny, przesyłający je poprzez filtry zaporowe do detektorów. 
Następnie dołączony system automatyki, sterowania oraz komputer zbiera i przetwarza uzyskane dane, 
co pozwala na ocenę parametrów co najmniej 100 komórek na sekundę. Liczba mierzonych 
parametrów zależy od rodzaju przyrządu. 

Wykorzystywane w tej metodzie barwniki to fikobiliproteiny: 



 

Fikoerytryna B, fikoerytryna R (światło czerwone) 



 

Fikocyjanina C, fikocyjanina R (światło fioletowe) 



 

Allofikocyjanina (światło zielone) 

Do oznaczania DNA w komórce stosowany jest jodek propidyny. 

 
Techniką cytometrii przepływowej możemy: 



 

Określić liczebność populacji komórek w badanym materiale 



 

Określić cechy morfologiczne (fenotyp) badanych komórek 



 

Ocenić stan czynnościowy komórek 



 

Oznaczyć stopień ekspresji antygenu na powierzchni komórek 



 

Oznaczać ilościowo niektóre białka (cytokiny) 

 
Wyznaczanie powyższych parametrów jest przydatne w diagnostyce klinicznej – umożliwia 
monitorowanie stanu immunologicznego w trakcie choroby i leczenia.  
 



 

Określić fenotyp komórek blastycznych w białaczkach ostrych 



  Diagnozować: 

- chłoniaki 
- białaczki przewlekłe 
- zespoły mielodysplastyczne (MDS) 



 

Oceniać DNA w komórkach białaczkowych 



 

Poszukiwać choroby resztkowej (MRD) 



 

Oceniać molekułę lekooporności (MDR) 



 

Monitorować pacjentów po przeszczepach allogenicznych i szpiku 



 

Badać komórki krwiotwórcze, retikulocyty i erytrocyty 



 

Oceniać morfologicznie i czynnościowo płytki krwi 



 

Określać jakościowo i ilościowo niedobory odpornościowe, oznaczać ilościowo klasy i 
podklasy immunoglobulin 



 

Diagnozować AIDS przez ocenę limfocytów CD4 



 

Wykrywać erytrocyty płodu we krwi matki 



 

Oznaczać ilościowo cytokiny 

 
Najczęściej stosowane markery to: 



 

CD45 leukocytów 



 

CD3 limfocytów 



 

CD19 i CD20 limfocytów B 



  CD15 neutrofili 



 

CD16 i CD56 komórek NK