Ewa Mizera-Nyczak

www.lek2002.prv.pl

Ewa Mizera-Nyczak

DIAGNOSTYKA CHORÓB AUTOIMMUNIZACYJNYCH

UKŁADOWYCH (NARZĄDOWO-NIESWOISTYCH)

Definicja

Choroby autoimmunizacyjne układowe są to choroby przewlekłe, w których reakcja

immunologiczna skierowana jest przeciwko własnym antygenom szeroko

rozpowszechnionym w wielu tkankach i narządach ustroju.

Zaliczamy do nich:

· choroby reumatyczne takie jak:

reumatoidalne zapalenie stawów,

młodzieńcze zapalenie stawów,
toczeń układowy,

zespół Sjoegrena,
twardzina (sklerodermia) ograniczona i układowa (w tym zespół CREST),

zapalenie wielomięśniowe/skórno-mięśniowe,

zespoły nakładania (w tym mieszana choroba tkanki łącznej),
zespół antyfosfolipidowy.

· zapalenia naczyń takie jak:

mikroskopowe zapalenie naczyń

guzkowe zapalenie tętnic
zespół Churg-Strauss

zespół Kawasaki
ziarniniak Wegenera

olbrzymiokomórkowe zapalenie tętnic

Dane ogólne

Do czynników etiologicznych zaliczamy:

· predyspozycję genetyczną – obserwuje się częstsze występowanie chorób dla

określonych haplotypów HLA klasy I i II: A1, B8, B27, DR1, DR2, DR3, DR4, DR7,

DQw1, DQw2, DQ3, DQw6, DQw7, DQw8;

· czynniki środowiska – infekcje wirusowe (Coxsackie, EBV, HCV), bakteryjne (Yersinia,

Klebsiella), leki (bleomycyna, izoniazyd, hydralazyna), oleje toksyczne, chlorek

winylu.

Mechanizm uszkodzenia narządów wiąże się najczęściej z depozytami kompleksów

immunologicznych w ścianie naczyń i reakcją podobną do III typu nadwrażliwości,

ewentualnie z bezpośrednim uszkodzeniem naczyń lub włókien mięśniowych np. przez
składowe dopełniacza, albo pobudzeniem fibroblastów przez cytokiny do nadmiernej

produkcji włókien kolagenowych.

Choroby te zwykle częściej występują u kobiet, mogą pojawiać się w każdym wieku –

większość w średnim, ale niektóre są typowe dla dzieci i młodzieży (młodzieńcze zapalenie

www.lek2002.prv.pl

stawów, zespół Kawasaki, toczeń noworodków), kobiet w III dekadzie życia (toczeń),

kobiet w VI dekadzie życia (reumatoidalne zapalenie stawów).

Przebieg kliniczny jest przewlekły z okresami remisji i zaostrzeń.

Ze względu na reakcję immunologiczną skierowaną przeciwko autoantygenom

rozpowszechnionym w ustroju obserwujemy zmiany w wielu narządach, najczęściej

w stawach, skórze, mięśniach, nerkach, błonach surowiczych, płucach, sercu, rzadziej

w przewodzie pokarmowym i w układzie nerwowym.

W przebiegu wielu chorób może dodatkowo rozwinąć się amyloidoza.

Objawy kliniczne

We wstępnej fazie chorób objawy są bardzo niecharakterystyczne: stany

podgorączkowe, ogólne osłabienie i zmęczenie. Następnie pojawiające się dolegliwości są
mniej lub bardziej specyficzne dla większości chorób: bóle i zapalenie stawów, bóle mięśni,

zmiany skórne o charakterze rumienia, stwardnienia lub guzków podskórnych, zmiany
zapalne naczyń, objaw Raynaud`a, zaburzenia czynności nerek lub serca, zapalenia błon

surowiczych (opłucnej, osierdzia), włóknienie śródmiąższowe płuc i zaburzenia

oddychania, zaburzenia pasażu w przewodzie pokarmowym, neuropatie, zapalenia
twardówki lub naczyniówki oka.

Ze względu na podobieństwo objawów występujących w różnych chorobach ważna jest

dobrze przeprowadzona diagnostyka różnicowa z pomocą badań dodatkowych.

Diagnostyka laboratoryjna

· Badanie ogólne krwi – często występuje leukocytoza z limfocytozą oraz anemia,

· OB i białka ostrej fazy (CRP) są wysokie w aktywnych stadiach choroby, są

pomocne w monitorowaniu aktywności uogólnionej reakcji zapalnej,

· Stężenie w surowicy składowych dopełniacza C3 i C4 – często obniżone lub

podwyższone; oraz produktów aktywacji dopełniacza C3d – często podwyższone.
Badanie ilościowe C3, C4 i C3d można wykonać za pomocą turbidymetrii –

metoda

opisana na str. 25

•

Stężenie immunoglobulin w surowicy – często hypergammaglobulinemia IgG,
materiał do badań stanowi krew pobrana „na skrzep” w ilości ok. 5ml. Badanie

ilościowe IgG można wykonać za pomocą turbidymetrii –

metoda opisana na str. 25

· Oznaczenie autoprzeciwciał w surowicy krwi – jest to najważniejsze badanie

dodatkowe w diagnostyce chorób autoimmunizacyjnych, w których dominuje

odpowiedź humoralna z wytworzeniem autoprzeciwciał (przeciw własnym
antygenom).

Materiał do badań stanowi krew pobrana „na skrzep” w ilości ok. 5ml

Oznaczanie większości autoprzeciwciał (zwłaszcza przeciwjądrowych) ze względu na dużą

różnorodność powinno być wykonywane wg następującego schematu:

1. badanie wstępne „skryningowe” –

metodą

immunofluorescencji pośredniej opisaną

na str.76

; - jakościowa ocena pozwalająca na stwierdzenie obecności autoprzeciwciał

i zaszeregowanie do określonego rodzaju,

2. badanie potwierdzające obecność określonego przeciwciała –

metodą blotową

opisaną na str.13

;

lub metodą ELISA (bez krzywej standardowej) opisaną na str.32

; -

jakościowa ocena pozwalająca określić swoistość autoprzeciwciała,

3. badanie ilościowe –

metodą ELISA

; ilościowa ocena badanego autoprzeciwciała.

www.lek2002.prv.pl

Nie w każdym przypadku wymagane jest badanie stężenia autoprzeciwciał, czasem

wystarczy jedynie określenie ich rodzaju, badanie ilościowe ważne jest np. w
monitorowaniu tocznia układowego (autoprzeciwciała anty-dsDNA) lub ziarniniaka

Wegenera (autoprzeciwciała ANCA).

W badaniu skryningowym reakcję immunofluorescencji przeprowadza się albo na

skrawkach tkanek zwierzęcych lub ludzkich albo na osadzie komórek, z użyciem anty-

ludzkiej antyglobuliny znakowanej barwnikiem fluorescencyjnym (

metoda opisana na

str.76

W chorobach autoimmunizacyjnych układowych najczęściej stwierdza się obecność

autoprzeciwciał przeciwjądrowych (ANA), które najlepiej wykrywać na osadzie

komórek linii HEp-2 (raka krtani) ewentualnie na skrawku wątroby szczura lub małpy
(„primate`a”). Oznaczanie na skrawku wątroby pozwala na wykrycie i zaszeregowanie

ANA do czterech typów morfologicznych fluorescencji: homogennego, plamkowego,
obwodowego i jąderkowego. Badanie na osadzie z komórek HEp-2 pozwala na

dokładniejsze określenie rodzaju ANA, pewniejsze określenie typu homogennego ANA

(charakterystycznego dla autoprzeciwciał anty-dsDNA), wykrycie autoprzeciwciał anty-SSA
i anty-SSB, anty-Jo1 i przeciw centromerom. Zasugerowanie obecności tych

autoprzeciwciał wymaga jednak dalszego potwierdzenia metodą z wyizolowanym
oczyszczonym antygenem (blot lub ELISA) i ewentualnego badania ilościowego (ELISA).

Autoprzeciwciała anty-dsDNA można wykrywać również na osadach z Crithidia luciliae,
które mają kinetoplast zawierający czyste dsDNA.

W zapaleniach naczyń najczęściej stwierdza się obecność autoprzeciwciał przeciw

ziarnistościom cytoplazmy neutrofili (ANCA), które najlepiej oznaczać ilościowo

(monitorowanie aktywności choroby) metodą ELISA – z dołkami opłaszczonymi enzymami
neutrofili: mieloperoksydazą (pANCA) lub proteinazą3 (cANCA); ewentualnie można

wykonać badanie jakościowe za pomocą reakcji fluorescencji na osadzie z ludzkich

neutrofili grupy krwi „O, Rh-ujemny”- ale jest to tylko badanie skryningowe.

Niektóre autoprzeciwciała można oznaczać tylko metodą ELISA np. anty-

kardiolipinowe występujące w zespole antyfosfolipidowym lub w toczniu układowym.

Czynnik reumatoidalny (RF), który jest autoprzeciwciałem (najczęściej w klasie

IgM) skierowanym przeciwko autologicznej IgG wykrywa się za pomocą metod

aglutynacyjnych np.

testem lateksowym opisanym na str.11

Najczęściej występujące autoprzeciwciała w chorobach autoimmunizacyjnych układowych
przedstawiono

w tabeli nr 1.

· Oznaczanie kompleksów immunologicznych w materiale z biopsji skóry

Materiał do badania stanowi drobny wycinek skóry (o wym. 3-5mm), który po

pobraniu umieszczony w naczyniu z solą fizjologiczną powinien być szybko przekazany
do pracowni immunologii celem zamrożenia

Na skrawkach kryostatowych z pobranego materiału wykonuje się reakcję

immunofluorescencji bezpośredniej z użyciem przeciwciał anty-ludzkich przeciwko
immunoglobulinom IgG, IgA, IgM i składowym dopełniacza C3, C1q, C4, oraz

przeciwko fibrynogenowi, znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym (

metoda

opisana na str.76

Obecność złogów immunologicznych na granicy naskórkowo-skórnej i w ścianach

naczyń skóry właściwej jest typowa dla tocznia układowego.

www.lek2002.prv.pl

· Oznaczanie złogów immunologicznych w materiale z biopsji nerki

Materiał do badania stanowi bioptat nerki, który po pobraniu umieszczony w

naczyniu z gazikiem nasączonym solą fizjologiczną powinien być szybko przekazany do

pracowni immunologii celem zamrożenia

Na skrawkach kryostatowych z pobranego materiału wykonuje się reakcję

immunofluorescencji bezpośredniej z użyciem przeciwciał anty-ludzkich przeciwko

immunoglobulinom IgG, IgA, IgM i składowym dopełniacza C3, C1q, C4, oraz
przeciwko fibrynogenowi, znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym.

Obecność złogów immunologicznych w kłębuszkach nerkowych można stwierdzić w

niektórych chorobach autoimmunizacyjnych przebiegajacych z zajęciem nerek np. w

toczniu układowym.

Jednocześnie powinno być wykonane badanie histopatologiczne bioptatu nerki.

· Badanie immunologiczne materiału biopsyjnego mięśnia szkieletowego

Materiał do badania stanowi drobny wycinek skórno-mięśniowy (o wym. ok. 5-

10mm), który po pobraniu umieszczony w naczyniu z solą fizjologiczną powinien być

szybko przekazany do pracowni immunologii celem zamrożenia.

Na skrawkach kryostatowych z pobranego materiału wykonuje się reakcję

immunofluorescencji bezpośredniej z użyciem przeciwciał anty-ludzkich przeciwko

immunoglobulinom IgG, IgA, IgM i składowym dopełniacza C3, C1q, C4, C5-C9 oraz
przeciwko fibrynogenowi, znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym.

Obecność końcowych fragmentów dopełniacza (C5-C9) w mięśniu jest typowa dla

zapalenia wielomięśniowego.

Jednocześnie powinno być wykonane badanie histopatologiczne wycinka skórno-

mięśniowego.

· Badanie histopatologiczne wycinka mięśnia szkieletowego z naczyniami

w diagnostyce zapaleń naczyń.

· Badania czynnościowe płuc, serca, nerek w przypadku zajęcia tych narządów przez

proces chorobowy.

Przykłady diagnostyki chorób autoimmunizacyjnych układowych

Toczeń układowy

Objawy kliniczne

kobieta w młodym wieku (ok. 30rż), skarży się na osłabienie, zmęczenie, bóle stawów;

często rumień na twarzy i odsłoniętych częściach ciała, obrzęki na kończynach dolnych,
powiększone węzły chłonne i śledziona

Badania laboratoryjne

Materiał do badań: krew

badanie ogólne: często leukopenia z limfocytozą, anemia, trombocytopenia;

wysokie OB.

Materiał do badań: surowica

- CRP: często w normie

- stężenie immunoglobulin: hypergammaglobulinemia IgG
- stężenie składowych dopełniacza C3 i C4: często obniżone

www.lek2002.prv.pl

- stężenie produktów aktywacji dopełniacza C3d: podwyższone

- oznaczanie autoprzeciwciał:

skryning ANA na HEp-2 : typ homogenny (anty-dsDNA, przeciw histonom),

+/- typ plamkowy (anty-Sm, anty-SSA, anty-SSB, anty-RNP),
+/- anty-PCNA,

+/- anty-rybosomalne białko P,

badanie potwierdzające specyficzność autoprzeciwciał ANA (metoda blotowa/ELISA)
oznaczenie ilościowe anty-dsDNA (metodą ELISA)

+/- ANCA
+/- anty-kardiolipinowe (w zaburzeniach zakrzepowo-zatorowych)

Materiał do badań: wycinek skóry

- oznaczanie kompleksów immunologicznych: często złogi immunologiczne (Ig, C)

na granicy naskórkowo-skórnej i w naczyniach skóry właściwej

Materiał do badań: bioptat nerki

- oznaczanie kompleksów immunologicznych: często złogi immunologiczne (Ig, C)

w kłębuszkach

- badanie histopatologiczne bioptatu nerki

Poza w.wym. badanie czynności zajętych narządów (nerek, serca, płuc).

Choroba (ziarniniak) Wegenera

Objawy kliniczne:

mężczyzna lat 45, skarży się na osłabienie, zmęczenie, bóle stawów i mięśni; często

zapalenia górnych i dolnych dróg oddechowych, płuc z krwiopluciem (do różnicowania z

nowotworem), zmiany zapalne na skórze, neuropatie obwodowe, objawy niewydolności

nerek

Badania laboratoryjne:

Materiał do badań: krew

- badanie ogólne: często leukocytoza, anemia, trombocytoza, łagodna eozynofilia;

wysokie OB .

Materiał do badań: mocz

- wykładniki nieprawidłowej czynności nerek (białkomocz, erytrocyturia)

Materiał do badań: surowica

- CRP: wysokie
- oznaczanie autoprzeciwciał

+ cANCA (przeciw proteinazie 3), rzadko pANCA (przeciw mieloperoksydazie)
+/- czynnik reumatoidalny

Materiał do badań: wycinek skórno-mięśniowy

- badanie histopatologiczne: ziarniniakowe zapalenie naczyń z martwicą włóknikowatą

Materiał do badań: bioptat nerki

- oznaczanie kompleksów immunologicznych: często negatywne, rzadziej złogi Ig, C

i fibrynogenu w naczyniach i kłębuszkach

- badanie histopatologiczne bioptatu nerki

Poza w.wym. badanie czynności zajętych narządów (nerek, płuc).

www.lek2002.prv.pl

Tabela nr 1.

Najczęściej występujące autoprzeciwciała w chorobach autoimmunizacyjnych

narządowo-nieswoistych , w tym w zapaleniach naczyń

W nawiasach podano częstość występowania w danej jednostce chorobowej

Jednostka chorobowa

Autoprzeciwciała

Reumatoidalne zapalenie

stawów

RF (67-85%)
ANA: anty-hnRNP,
RANA (90-95%)

Młodzieńcze zapalenie

stawów

ANA: anty-Ro, p.histonom (37%)
RF<5%

Toczeń układowy

ANA (typ homogenny, obwodowy, plamkowy):

anty-dsDNA (60-90%), anty-Sm (20-40%),
anty-Ro (20-60%), anty-La (10-20%),

p.histonom (30-70%), anty-RNP (30-40%)
anty-kardiolipinowe (20-40%)
p.rybosomalnemu białku P (5-20%)
anty-PCNA (3%)
+/- ANCA

Zespół Sjoegrena

RF (90%),
ANA (typ plamkowy): anty-Ro (40-95%), anty-

La (40-95%)

Twardzina układowa

ANA (typ jąderkowy): anty-Scl70 (25-75%),

p.centromerom (80-95% CREST), p.fibryllarynie

(5-10%)

Zapalenie wielomięśniowe/
skórno-mięśniowe

anty-Jo1 (25%)

Zapalenie mięśni +

twardzina

anty-PM-Scl (50-70%)

Mieszana choroba tkanki

łącznej

ANA: anty-U1RNP (95-100%)

Zespół antyfosfolipidowy

anty-kardiolipinowe

Mikroskopowe zapalenie

tętnic

pANCA (45%), cANCA (45%)

Guzkowe zapalenie tętnic ANCA

negatywne!

Zespół Churg-Strauss

pANCA (60%), cANCA(45%)

Zespół Kawasaki

ANCA

Ziarniniak Wegenera

cANCA (85%), pANCA (10%)

Olbrzymiokomórkowe

zapalenie tętnic

ANCA negatywne!

www.lek2002.prv.pl

Jan Żeromski

CHOROBY AUTOIMMUNIZACYJNE

NARZĄDOWO-SWOISTE

Definicja

Są to choroby, w których celem ataku autoimmunizacyjnego jest jakiś narząd, tkanka

lub określona struktura histologiczna/biochemiczna. Objawy chorobowe są zwykle
następstwem zniszczenia lub uszkodzenia funkcji celu ataku.

Zapamiętaj!

Choroby te często dotyczą gruczołów wydzielania wewnętrznego i wtedy

noszą nazwę endokrynopatii. Zwykle prowadzą do niedoboru danego
hormonu, ale moga równiez powo-dować nadczynność gruczołu, np.

tarczycy. W chorobach narządowo-swoistych dominują mechanizmy
nadwrażliwości typu II.

Dane ogólne:

Immunodiagnostyka tych chorób jest zwykle związana z obecnością autoprzeciwciał

przeciwko autoantygenom danego narządu. Często są to hormony lub ich receptory ale

także enzymy i inne białka. Część tych chorób wykazuje cechy zarówno narządowo-
swoistych jak i nieswoistych, np. w pierwotnej marskości żółciowej występują nie tylko

zmiany w wątrobie jako obiekcie ataku immunologicznego ale obecne są także

przeciwciała przeciw-mitochondrialne (AMA), NB. o ważnym znaczeniu diagnostycznym.
Mitochondia, jak wiadomo, występują niemal w każdej komórce ustroju, trudno więc

mówić o swoistości narządowej!

Leczenie typowych chorób narządowo-swoistych jak endokrynopatie, sprowadza się

często do zastąpienia funkcji zniszczonego gruczołu dokrewnego, jak np. podawanie

insuliny w cukrzycy typu I.

Podział chorób narządowo swoistych

Typowe

· Zapalenie tarczycy typu Hashimoto

· Choroba Graves-Basedowa
· Wrodzony obrzęk śluzakowaty

· Choroba Addisona

· Autoimmun. niewydolność przytarczyc
· Zespoły mnogich autoimmun. endokrynopatii

· Cukrzyca typu młodzieńczego
· Autoimmun. niepłodność (męska i żeńska)

· Zanikowe autoimmun. zapalenie żołądka

· Anemia złośliwa
· Miastenia

www.lek2002.prv.pl

Mieszane

· Pierwotna marskość żółciowa
· Przewlekłe autoimmun. zapalenie wątroby

· Autoimmun. anemia hemolityczna
· Idiopatyczna trombocytopenia

· Idiopatyczna leukopenia

· Wrzodziejace zapalenie jelita grubego
· Choroba Leśniowskiego-Crohna

· Stwardnienie rozsiane
· Autoimmun. zapalenie naczyniówki oka

· Zapalenie sympatyczne oka

· Zespół Goodpasture’a

Diagnostyka chorób narządowo-swoistych

Diagnostyka endokrynopatii

objawy kliniczne

ocena produkcji hormonu i inne badania laboratoryjne

oznaczenie ilosciowe Ig w surowicy - turbidymetria (

metoda opisana na str.23

)

badanie

przesiewowe

(skrining) obecnosci autoprzeciwciał -

immunofluorescencja pośrednia (

metoda opisana na str.76

)

poszukiwanie autoprzeciwciał znamiennych dla danej choroby

określenie szczegółowej swoistości i ew. miana autoprzeciwciał

Diagnostyka pozostałych chorób narządowo-swoistych

objawy kliniczne

rutynowe badania laboratoryjne

oznaczenie ilosciowe Ig i ew. składowych dopełniacza w surowicy (met.

turbidymetrii)

skrining autoprzeciwciał (met. immunofluorescencji pośedniej)

ew. badanie immunomorfologiczne biopsji narządowej (met.

immunofluorescencji bezpośredniej )

oznaczenie obecności autoprzeciwciał typowych dla danej choroby

określenie szczegółowe swoistości i ew. miana znalezionego przeciwciała

Przykłady

Ad 1.

Zapalenie tarczycy typu Hashimoto

- Ad.a. kobieta w średnim wieku, z zaznaczoną nadwagą skarży się na widoczne

powiększenie obwodu szyi w części przedniej, ogólne osłabienie i spadek
aktywności życiowej

- Ad.b. spadek stężenia tykoksyny (T3) i trójjodotyroniny (T4) w surowicy;

Oligobiopsja tarczycy – nacieki limfocytarne miąższu

- Ad.c. wzrost stężenia Ig, najczęściej IgG (u części chorych)

- Ad.d. obecność autoprzeciwciał p-ko tyreoglobulinie i p-ko mikrosomom

tarczycowym (peroksydazie tarczycowej);

- Często –obecne przeciwciała p-ko komórkom okładzinowym żołądka

www.lek2002.prv.pl

- Ad.e. przeciwciała p-ko tyreoglobulinie - test ELISA p. str, peroksydazie tarczyc.

- ELISA, inne; receptorowi dla TSH (blokujące) – hodowla

in vitro

komórek tarczycy

+ surowica chorego

Ad 2.

Przewlekłe autoimmunizacyjne zapalenie wątroby (AZW)

- Ad.a. zaburzenia trawienia, powiększenie wątroby, stan podżółtaczkowy, trądzik,

pajączki w skórze.

- Ad.b. wzrost OB, wzrost stężenia enzymów wątrobowych (AlAT, AsPaT, GTTP),

brak obecności antygenów wirusowych (HBV, HCV) i odpowiednich przeciwciał w
surowicy.

- Ad.c. wzrost stężenia gamma globulin (wszystkich 3 klas Ig, zwłaszcza IgG).

- Ad.d. obecność autoprzeciwciał (ANA, SMA i inne).
- Ad.e. obecne p-ciała przeciwko nukleoproteinie i p-ko F-aktynie (typ I AZW).

- lub p-ko mikrosomom nerki/wątroby (typ II AZW).
- Ad.f. anty LKM1 (cytochrom P-450 IID6) metoda: ELISA (

metoda opisana na

str.32

) lub blotowa (

metoda opisana na str.13

)

- Anty SLA/LP (rozpuszczalny antygen wątrobowy/wątrobowo-trzustkowy) (typ III

AZW); metoda: blotowa.

Zapamiętaj!

Oprócz typowego AZW istnieją tzw. zespoły nakładania (ang. overlap
syndromes), w których obok AZW obecne inne objawy i autoprzeciwciała.

Należą tu:

- AZW i pierwotna marskość żółciowa:

Immunodiagnostyka: autoprzeciwciała jak w AZW + AMA (p-ciała

przeciwmitochondrialne).

- AZW i pierwotne stwrardniające zapalenie dróg żółciowych:

Immunodiagnostyka: jak w AZW + pANCA metodą

immunofluorescencji pośredniej na rozmazach granulocytów lub met.
ELISA

www.lek2002.prv.pl

Grzegorz Dworacki

DIAGNOSTYKA FENOTYPOWA CHORÓB

ROZROSTOWYCH UKŁADU KRWIOTWÓRCZEGO

Immunofenotyp – definicja

Jest to charakterystyczny zbiór antygenów stanowiących elementy różnych struktur

komórki, związany z jej różnicowaniem, dojrzewaniem i funkcją.

Dane ogólne

Wskazania do wykonywania badań immunofenotypowych:

•

Stany przebiegające z leukocytozą bądź limfocytozą i leukopenią bądź limfopenią
stwierdzane przy braku wyraźnego czynnika sprawczego, bądź utrzymujące się

pomimo zastosowanego leczenia.

•

Diagnostyka i różnicowanie białaczek

•

Diagnostyka powiększonych węzłów chłonnych, różnicowanie chłoniaków

•

Stwierdzenia białka monoklonalnego w surowicy

Materiał biologiczny do badań

· Krew obwodowa

· Szpik kostny
· Płyn mózgowo-rdzeniowy

· Wysięki z jam ciała

· Komórki izolowane z węzłów chłonnych
· Materiał z biopsji cienkoigłowej

· Materiał biopsyjny (skrawki kriostatowe) i parafinowe
Materiał biologiczny musi być świeży, nieutrwalony (węzły chłonne utrwalone formaliną

nie nadają się do oceny). Musi on byś sterylnie pobrany, a krew i szpik zabezpieczone

przed skrzepnięciem. Najlepiej pobrane do probówki z wersenianem sodu (EDTA), bądź
heparyną. Dla typowych potrzeb oceny immunofenotypowej wystarczy pobrać 2-3 ml krwi

i 1-2 ml szpiku. Węzły chłonne powinny być zabezpieczone przed wysychaniem, najlepiej
zawinięte w gazik nasączony roztworem soli fizjologicznej i zamknięte w komorze wilgotnej

(penicylinówka zamknięta korkiem). Materiał biologiczny powinien być dostarczony do
pracowni możliwie jak najszybciej, w warunkach które zabezpieczają przed nadmierna

temperaturą, optymalnie w łaźni lodowej. Krew i szpik nadają się do oceny przez 8-12

godzin od pobrania. Zawsze materiał biologiczny należy dostarczyć dokładnie opisany i z
podaniem dokładnych

danych klinicznych (wiek, płeć, czas trwania objawów,

dotychczasowe leczenie). Należy również podać wynik aktualnej, leukocytozy, rozmazu
krwi.

Metody oceny immunofenotypu

Ocena immunofenotypu łączy się z identyfikacją białek, a dokładniej antygenów

istotnych z punktu widzenia analizowanych typów komórek, ich cech. Oceny tej dokonuje

się poprzez zastosowanie najczęściej przeciwciał monoklonalnych, rzadziej oczyszczonych

www.lek2002.prv.pl

przeciwciał poliklonalnych. W odniesieniu do zawiesin komórkowych (np. izololowane

komórki węzłów chłonnych) oraz tkanek płynnych (krew, szpik) do oceny immunofenotypu
najlepiej nadaje się wielokolorowa cytofluorymetria przepływowa (

metoda opisana na

str.48

). Do oceny immunofenotypu materiału tkankowego wykorzystujemy metody

immunohistochemiczne (najczęściej ABC i APAAP) oraz rzadziej immunofluorescencyjne

(

metoda opisana na str. 76

Podstawowe markery i cechy fenotypowe lini komórkowych

CD45 - marker wszystkich leukocytów.

CD19, CD20 - markery limfocytów B
CD3, CD7 - markery limfocytów T

CD4 - marker limfocytów T pomocniczych

CD8 - marker limfocytów T supresorowych
CD56 - marker komórek NK

CD25, CD71, CD69 - markery aktywacji limfocytów
CD13, CD33 - markery różnicowania mieloidalnego

CD15 - marker granulocytów.

CD14 - marker monocytów.
CD34 - podstawowy marker komórek progenitorowych (macierzystych).

Markery oceny klonalności rozplemu limfocytów B

Oceniana jest dla limfocytów B na podstawie ekspresji łańcuchów lekkich kappa i

lambda immunoglobulin, a dla limfocytów T może być oceniana poprzez na podstawie

określenia rodziny TCR Vb, bądź Vg.

Fenotyp krwi obwodowej u osoby zdrowej

Podstawowa ocena fenotypowa leukocytów krwi obwodowej powinna zawierać

względne i bezwzględne! wartości określające następujące subpopulacje komórek:

1. granulocytów obojętnochłonnych, kwasochłonnych i zasadochłonnych (CD45+

CD14-)

2. monocytów (CD45+CD14+)

3. limfocytów (CD45+):

- B (CD19+, CD20+),
- T (CD3+),

- T pomocniczych (CD3+CD4+),
- T cytotoksyczno/supresorowych (CD3+CD8+),

- komórek NK (CD56+CD16+CD3-).

4. stosunek limfocytów CD4/CD8 (w warunkach normy 1-1,5),

5. ocenę markerów aktywacji limfocytów: CD3+HLA DR+, (w wybranych

przypadkach CD25, CD71, CD69).

Należy zwrócić uwagę, że skład subpopulacji leukocytów krwi odwodowej zmienia się w

zależności od wieku. U dzieci przeważają limfocyty u dorosłych granulocyty. U dzieci

odsetkowo więcej jest limfocytów B niż w populacji dorosłej. Wartości populacji dorosłej

ustalają się w okresie pokwitania. U osób w wieku podeszłym zauważalna jest tendencja
do wzrostu odsetka komórek NK.

www.lek2002.prv.pl

Cechy rozplemu odczynowego limfocytów

· Limfocytoza nieprzekraczająca 4-5 tys/mm

; powyżej 10 tys/mm

należy

poważnie myśleć o rozplemie nowotworowym,

· Rozplem odczynowy limfocytów najczęściej dotyczy limfocytów T. Cechami

fenotypowymi są: odwrócenie stosunku CD4/CD8 i wzrost odsetka komórek

wykazujących markery aktywacji (podstawowe HLA-DR, CD25, CD69, CD71).

Cechy fenotypowe pomocne w identyfikacji i charakterystyce rozplemu
nowotworowego

•

Ujawnienie cech monoklonalności rozplemu.

•

Pojawienie się komórek niskozróżnicowanych i niedojrzałych (z antygenu CD34)

•

Utrata antygenów charakterystycznych dla komórki normalnej

•

Pojawienie się na komórkach obcego antygenu z innej linii różnicowania.

•

Aneuploidalna ilość DNA w populacji komórek.

•

Ujawnienie charakterystycznego dla danego typu rozplemu nowotworowego
fenotypu np. w przewlekłej białaczce limfatycznej CD19+ CD5+CD23

Przykłady kliniczne

Przypadek 1

Badanie podmiotowe:

Mężczyzna lat 62 z narastającym od kilku miesięcy osłabieniem, łatwym męczenie się,

dusznością wysiłkową, kilkakrotną infekcją w ciągu ostatnich dwóch miesięcy. Aktualnie

obustronne zapalenie płuc.

Badanie przedmiotowe:

•

Powiększone obustronnie węzły chłonne pachowe, pachwinowe i szyjne o średnicy

0,5-2cm

•

Miernie powiększona wątroba i śledziona

•

Zacienienie obustronne dolnych płatów płuc

•

Stłumienie odgłosu opukowego i trzeszczenia nad obu płucami

Badania laboratoryjne:

•

Hemoglobina 11.2g/dl

•

Leukocytoza (WBC) 38x109/l

•

Rozmaz krwi obwodowej – 90 % małych limfocytów

•

IgG 2.,1 g/l (norma 7,2-19g/l), IgA 0,6g/l (norma 0,8-5,0g/l), IgM 0,4g/l (norma

0,5-2g/l), nie stwierdzono obecności białka monoklonalnego.

Badanie histopatologiczne węzła chłonnego:

Struktura węzła całkowicie zatarta, obecne naciekanie torebki węzła. W utkaniu

widoczna jednorodna, monotonna populacja małych limfocytów.

www.lek2002.prv.pl

Badania fenotypowe:

•

Cytometria przepływowa krwi obwodowej: w badaniu fenotypowym krwi
obwodowej (cytometria przepływowa) stwierdzono populację 77% małych

limfocytów wykazujących ekspresję antygenów CD19+, CD20+, CD5+, CD23+.

•

Badanie immunohistochemiczne węzła chłonnego: w utkaniu węzła chłonnego

obecna jednorodna populacja małych limfocytów wykazująca ekspresję antygenów

CD45(LCA) i CD20.

Rozpoznanie:

przewlekła białaczka limfatyczna (B-CLL)

Jest to najczęstsza choroba rozrostowa wieku średniego i podeszłego o stosunkowo

łagodnym przebiegu. Komórki nowotworowe z charakterystycznym fenotypem
nowotworowych komórek B (CD19+) wykazujących ekspresję antygenów CD5, CD23, oraz

słabą ekspresją immunoglobulin powierzchniowych.

Przypadek 2

Badanie podmiotowe

Mężczyzna lat 46 skarży się na nadmierne pocenie, spadek masy ciała o 5kg w okresie

ostatnich 3 miesięcy. Ma powiększone węzły chłonne szyjne po obu stronach oraz w

prawym dole pachowym od dwóch miesięcy. Węzły pojedyncze i w pakietach, największy

o średnicy 5cm. Nie zmniejszyły się pomimo leczenia antybiotykami.

Badanie podmiotowe:

Powiększone węzły chłonne: niebolesne, pojedyncze, nie w pakietach, przesuwalne w

stosunku do otoczenia. Wątroba i śledziona niepowiększone.

Badania laboratoryjne:

- Hemoglobina 11,6 g/dl

- Leukocyty 4,6 x 10 3/mm3
- OB 82mm/h

- Rozmaz krwi obwodowej bez odchyleń

www.lek2002.prv.pl

Ocena makroskopowa, histopatologiczna immunohistochemiczna węzła:

Do badania pobrano jeden prawy węzeł szyjny.
Węzeł, otorebkowany, o wzmożonej spoistości, o wymiarach 2x3,5cm, na przekroju

szaro-biały, jednorodny, bez zmian ogniskowych.

Utkanie węzła podzielono na trzy fragmenty:

- jeden utrwalono w buforowanej formalinie (materiał do badań

histopatologicznych i immunomorfologicznych)

- drugi fragment zamrożono (materiał do rozszerzonych badań

immunomorfologicznych)

- trzeci fragment posłużył do izolacji komórek, których immunofenotyp został

oceniony w cytofluorymetrii przepływowej.

Mikroskopowo struktura węzła całkowicie zatarta, widoczne tworzące się, włókniejące

guzki w nacieku komórek zapalnych. Obecne pojedyncze duże komórki z wyraźnym
jąderkiem, podobne do komórek Hodgkin’a i Reed-Sternberga.

Badania fenotypowe: na obecność antygenów CD15 i CD30 (w materiale tkankowym

utrwalonym w formalinie i zatopionym w kostce parafinowej) ujawniły obecność

antygenów CD15 i CD30 w błonie i cytoplaźmie komórek sugerowanych jako komórki
Hodgkin’a i Reed-Sternberga.

Rozpoznanie ostateczne

Ziarnica złośliwa (lymphogranulomatosis maligna).

www.lek2002.prv.pl

Husam Samara, Mirosław Szczepański

NIEDOBORY ODPORNOŚCI

Ogólna charakterystyka

Niedobory odporności (N.O.) (wrodzone i nabyte) obejmują grupę chorób / zespołów

chorobowych spowodowanych częściowym lub całkowitym brakiem ilościowym i/lub
jakościowym w obrębie układu immunologicznego.

Zapamiętaj!

N.O. mogą ujawniać się nietypowo, ale objawami dominującymi są
najczęściej długotrwałe, trudno poddające się leczeniu, nawracające

infekcje głównie układu oddechowego, moczowego i skóry.

N.O. stanowią trudny problem diagnostyczny i z tego powodu są zwykle zbyt rzadko

rozpoznawane. W niniejszym opracowaniu został położony nacisk gł6wnie na diagnostykę
pierwotnych (wrodzonych) niedobor6w odporności, kt6re są domeną pediatrii. Nie zostało

jednak pominięte monitorowanie najbardziej znanego przykładu wt6rnego niedoboru

odporności jakim jest AIDS. Celem autor6w jest aby student zrozumiał istotę problemu
niedobor6w odporności, umiał szukać ich przyczyn poprzez celowaną diagnostykę,

odpowiednio pokierować pacjenta do ośrodka specjalistycznego (np. I.P. - Centrum
Zdrowia Dziecka w Warszawie).

Obecnie nie wykonuje się testów przesiewowych w kierunku N.O.. u noworodków, co

wynika z r6znorodności grupy N.O. i kosztów badań immunologicznych. Dlatego tak

istotne jest aby w przypadku podejrzenia N.O. (tab. 2) wykonać odpowiednie badania
układu immunologicznego potwierdzające lub wykluczające N.O.

Natomiast dzisiejsze możliwości leczenia w przypadku N.O. pierwotnych to głównie:

suplementacja gammaglobulin, celowana antybiotykoterapia, czynniki wzrostu - jest to

jedynie leczenie objawowe i to przez całe życie. Wykonuje się również przeszczepy szpiku
kostnego w przypadku ciężkich niedoborów (np. SCID) – leczenie przyczynowe. Są także

pierwsze udane próby terapii genowej (niedobór ADA – dezaminazy adenozyny). Dane te
świadczą o tym jak mało jeszcze można zrobić w przypadku chorób uwarunkowanych

genetycznie jakimi są pierwotne niedobory odporności.

www.lek2002.prv.pl

Zapamiętaj!

Tab. 2

OBJAWY SUGERUJĄCE ZABURZENIA ODPORNOŚCI

(oprac. przez Konsult. Kraj. i Reg. w Immun. Klin. i

PTIDiK)

1. nawracające zakażenia dróg oddechowych w ciągu roku

2. dwa lub więcej zakażenia zatok w ciągu roku
3. powikłania pooperacyjne np. niegojące się rany

4. ponad dwumiesięczna antybiotykoterapia bez wyraźnej

poprawy

5. dwa lub więcej zapalenia płuc w ciągu roku

6. nawracające ropnie skónie lub narządowe
7. przewlekająca się grzybica

8. dwa lub ciężkie zakażenia tkanek i narządów
9. nawracające zakażenia układu moczowego po

wykluczeniu innych przyczyn

10. uczucie przewlekłego zmęczenia

Podział niedoborów odporności

Tab.3

PIERWOTNE (wrodzone)

WTÓRNE (nabyte)

· Zdecydowanie rzadsze niż

wtórne N.O.

· Spowodowane defektem

genetycznym

· Mogą ujawnić się już w okresie

noworodkowym

· Obecnie znanych jest ok.60

pierwotnych N.O.

· Stanowią większość niedoborów

odporności

· Spowodowane czynnikiem zewn.

lub towarzyszącą chorobą:

- Niedożywienie

- AIDS

- Leki immunosupresyjne
- W przebiegu: niewyd.

nerek, wątroby, przewl.
infekcji, nowotworów

Pierwotne N.O. - przykłady

Klasycznie dzieli się je na niedobory dotyczące defektu lub braku:
1. Limfocytów B à zaburzenia odporności humoralnej swoistej (przeciwciała-Ab):

- izolowany niedobór IgA à najczęstszy pierwotny N.O., ok. 1/600 urodzeń;

zaburzenie dojrzewania limf. B w komórki plazmatyczne,

- CVID (common variable immunodeficiency) à pospolity zmienny niedobór

odporności; dominują zaburzenia odporności komórkowej i towarzyszyć mogą

zaburzenia odporności humoralnej; przyczyną jest najprawdopodobniej

www.lek2002.prv.pl

zaburzenia przekazywania sygnału z limf. T do limf. B i nadmierna aktywność

supresorowa limf. T,

- Agammaglobulinemia sprzężona z chromosomem X (Brutona); defekt różnico-

wania limf. Pre-B do dojrzałych limf. B,

- Agammaglobulinemia dziedziczona autosomalnie recesywnie

- N.O. ze zwiększonym stężeniem IgM, IgE (zesp. Joba), brak sygnału

hamowania produkcji IgE, zaburzenie przełączania klas immunoglobulin w limf.
B, zaburzenia chemotaksji

2. Limfocytów T à zaburzenia odporności komórkowej swoistej (limf. pomocnicze,

cytotoksyczne, supresorowe)

- Zespół DiGeorge’a; zmniejszona liczba limf. T (CD3+) z towarzyszącymi

wadami wrodzonymi serca i hipokalcemią

- N.O. z brakiem limfocytów CD8+
- Selektywny niedobór limf. T

3. Komórek żernych (gł. Neutrofile i monocyty) à zaburzenia odporności

komórkowej nieswoistej – ilościowe, jakościowe: chemotaksji, fagocytozy, wybuchu
tlenowego

- Wrodzone neutropenie,
- Przewlekła choroba ziarniniakowa (CGD); mutacja w obrębie genu dla

oksydazy NADPH à upośledzenie wytwarzania aktywnych metabolitów tlenu w
kom. żernych (gł. w neutrofilach),

- Zaburzenia adhezji krwinek białych (LAD – leucocyte adhesion deficiency);

nieprawidłowa ekspresja cząsteczek adhezyjnych gł. CD11/CD18, często
pierwszym objawem jest długo gojąca się pępowina!

- Zespół Chediaka-Higashiego; zaburzenia chemotaksji, degranulacji i funkcji

cytotoksycznych, często towarzyszy temu albinizm, oczopląs, fotofobia,

upośledzenie umysłowe.

4. Składowych dopełnaicza à zaburzenia odporności humoralnej nieswoistej

(składowe dopełniacza C1-C9 i białek regulatorowych)

- Nawracające zakażenia bakteryjne,
- Choroby autoimmunizacyjne,

- Obrzęk naczynioruchowy (Quinckiego) à niedobór inhibitora C1.

5. Mieszane

Zespół Wiskotta-Aldricha; zaburzenie transdukcji sygnału

wewnątrzkomórkowego i funkcji cytoszkieletu, charakterystyczna triada
objawów: nawracające zakażenia, małopłytkowość i wyprysk skórny,

- SCID (severe combined immunodeficiency, ciężki złożony niedobór

odporności): niedobór dotyczy kilku populacji limfocytów T, B i NK w różnych
kombinacjach, powstaje w wyniku mutacji prowadzących do zaburzenia

przekazywania sygnałów różnicowania i dojrzewania, letalne w przypadku
nieleczenia (ciężkie infekcje),

- Zespół „nagich” limfocytów.

www.lek2002.prv.pl

Diagnostyka N.O.

Po szczegółowym badaniu podmiotowym (ważny wywiad rodzinny!), przedmiotowym

sugerującym obecność' N.O. (patrz tab. 2) i wykonaniu podstawowych badań

laboratoryjnych (często już one mogą wykluczyć N.O.,np. wrodzone neutropenie), należy
zbadać poszczególne elementy (zarówno swoiste jak i nieswoiste, komórkowe i

humoralne) układu immunologicznego

Odporność swoista (nabyta):

1. HUMORALNA à zaburzenie może dotyczyć liczby i/lub funkcji limfocytów B

Badania:

a) ocena gamma-globulin surowicy krwi

- elektroforeza białek surowicy,

- immunoelektroforeza (bad. półilościowe) (

metoda opisana na str.7

)

- pomiar stężenia podstawowych klas Ig: G, A, M, E à turbidymetria,

nefelometria (bad. ilościowe) (

metoda opisana na str.25

)

- oznaczanie podklas immunoglobulin (IgG1 - IgG4) à ELISA (

metoda

opisana na str.32

)

b) ocena odsetka i wartości bezwzględnej krążących limfocytów B

- cytometria przepływowa (limf. B à CD19+, CD20+) (

metoda opisana na

str.48

)

2. KOMÓRKOWA à zaburzenie może dotyczyć liczby i/lub funkcji limfocytów T

Badania:

a) ocena odsetka i wartości bezwzględnej krążących limfocytów T

- cytometria przepływowa (limf. T CD3+, Th CD4+, Tc CD8+)

b) ocena jakościowa

- markery aktywacji: ekspresja powierzchniowa MHC II (HLA-DR+), CD25+

(IL-2R), CD69+, CD71+ (receptor dla transferyny) - cytometria

przepływowa.

- odpowiedź proliferacyjna i cytotoksyczna na: mitogeny (transformacja

blastyczna), alloantygeny (mieszana hodowla limfocytów, ang. MLR; mixed

lymphocyte reaction) (

metoda opisana na str.63

)

- testy skórne (

metoda opisana na str.59

)

Odporność nieswoista (wrodzona):

1. HUMORALNA à zaburzenia dotyczące głównie składowych dopełniacza i białek

regulatorowych

Badania:

a) ocena jakościowa układu dopełniacza

- aktywność hemolityczna na drodze klasycznej (CH50) i alternatywnej

(AH50)

b) ocena ilościowa składowych dopełniacza

www.lek2002.prv.pl

- najczęściej C3 i C4 à turbidymetria

2. KOMÓRKOWA à komórki żerne (neutrofile i monocyty)

Badania:

a) ocena odsetka i wartości bezwzględnej krążących kom. żernych

- WBC i rozmaz

b) ocena czynnościowa

- zdolność do migracji i chemotaksji à komora Boydena (

metoda opisana na

str.67

)

- zdolność fagocytarna à indeks fagocytarny, cytometria przepływowa

(Fagotest) (

metoda opisana na str.68

)

- zdolność do wybuchu tlenowego à test redukcji NBT, test chemi-

luminescencji, cytometria przepływowa (Bursttest) (

metoda opisana na

str.68

)

AIDS

Badania immunologiczne w przypadku nabytego niedoboru immunologicznego jakim jest

AIDS w zasadzie spowadzają się do określenia przy użyciu cytometrii przepływowej:

•

bezwzględnej liczby limfocytów krwi obwodowej

•

stosunku limfocytów CD4+/CD8+ (u zdrowego >1)

Badania te mają przede wszystkim znaczenie rokownicze i oceniające odpowiedź

chorego na leczenie przeciwwirusowe.

Przykłady kliniczne

Przykład 1

Przewlekła choroba ziarniniakowa – CGD (Chronic Granulomatous Disease):

Objawy:

· najczęściej rozwijają sie do 2 r.ż.

•

przewlekłe infekcje trudne do leczenia

•

najczęściej zakażenia florą normalnie występującą lub nietypową

•

ropnie skóry, narządowe, kości, okołoodbytnicze

Przyczyna:

•

niedobór ilości lub funkcji oksydazy NADPH à zaburzona produkcja reaktywnych
form tlenu à zaburzenie wybuchu tlenowego komórek żernych

Diagnostyka:

•

test redukcji NBT u chorego dziecka i rodzeństwa

Leczenie:

•

objawowe (antybiotykoterapia i chirurgia)

•

interferon gamma

www.lek2002.prv.pl

Przykład 2

Zespół hiper-IgE (zespół Job’a)

Objawy:

charakterystyczna triada objawów (u ponad 75% pacjentów):

•

nawracające ropnie skóry, tk. podskórnej lub narządowe

•

nawracające infekcje dróg oddechowych

•

wzrost stężenia IgE

Dodatkowo zmiany skórne o charakterze wyprysku (różniące się lokalizacją od

atopowego zapalenia skóry) powikłane zakażeniami bakteryjnymi trudne w leczeniu,

częste zapalenia zatok wywołane gł. St.aureus lub Aspergillus, czasami kandydoza, póżne
wypadanie zębów mlecznych, częściej występujące choroby autoimmunizacyjne i

skłonność do nowotworzenia. Obserwuje się również zaburzenia chemotaksji

Diagnostyka:

•

stężenie IgE > 2000IU/ml (też często >5000IU/ml)

•

badanie chemotaksji

www.lek2002.prv.pl

Jan Sikora

PRZESZCZEPY NARZĄDOWE

Antygeny zgodności tkankowej

Antygeny zgodności tkankowej, zwane też antygenami transplantacyjnymi, są

odpowiedzialne za odrzucenie przeszczepu pochodzącego z innego osobnika tego samego
gatunku (alloprzeszczep). Zespoły genów determinujących struktury powierzchniowe

komórek o charakterze antygenów transplantacyjnych noszą nazwę głównego układu
zgodności tkankowej (major histocompatibility complex – MHC) lub HLA (human leukocyte

antigens). Geny te są zlokalizowane na krótszym ramieniu chromosomu 6. Region ten

obejmuje 224 miejsca (

loci

) genowe. Uproszczony schemat organizacji genów HLA na

chromosomie 6 przedstawia poniższa rycina.

www.lek2002.prv.pl

Rodzaje przeszczepów

1. Autologiczny: pochodzący od samego biorcy,
2. Syngeniczny: pochodzący od identycznego genetycznie innego osobnika tego

samego gatunku,

3. Allogeniczny: pochodzący od innego osobnika tego samego gatunku, różnego

genetyczne od biorcy,

4. Ksenogeniczny:międzygatunkowy.

Podstawowe badania immunologiczne w transplantologii

· Badania w zakresie podstawowych grup krwi
· Badania w zakresie antygenów zgodności tkankowej HLA klasy I (A i B)

Badania tych antygenów przeprowadza się metodami serologicznymi z zastoso-

waniem 60-dołkowych płytek Terasaki. Do poszczególnych dołków wprowadza się
przeciwciała przeciw poszczególnym antygenom HLA, wyizolowane zakresie krwi

osoby badanej limfocyty oraz komplement. Kompleks antygen przeciwcialo wiąże
dopełniacz co powoduje uszkodzenie błony komórkowej i w konsekwencji

zabarwienie komórki po wprowadzeniu odpowiedniego barwnika (np. eozyny).

· Badania w zakresie antygenów HLA klasy II (DR)

Badania tych antygenów przeprowadza się z zastosowaniem metod genetycznych,

przy pomocy PCR.

· Próba krzyżowa (cross-match)

Jest to krzyżowy test cytotoksyczny z użyciem surowicy biorcy i limfocytów od

różnych dawców pozwalający na określenie występowania w osoczu biorcy

alloprzeciwciał. Jest wykonywany przy pomocy metody serologicznej. Pozwala na

wykrycie przeciwciał wiążących komplement.

Przeszczepy nerek

Dobór immunologiczny dawcy i biorcy

•

W zakresie układu AB0

•

W zakresie HLA I A i B (typowanie serologiczne)

•

W zakresie HLA II DR (typowanie genetyczne)

•

Cross-match – Obecność przeciwciał IgG swoistych dla antygenów HLA I A i/lub B

w surowicy biorcy w dniu przeszczepu prowadzi do nadostrego odrzucenia
przeszczepu nerki

Przechowywanie nerek przed transplantacją

· Ze zwłok w hipotermii, 24 h, po przepłukaniu płynem konserwujących

(Eurocollins, Vispan, Custodiol)

· Z żywych dawców – bezpośrednio

www.lek2002.prv.pl

Odrzucanie przeszczepu nerki

· Nadostre – bezpośrednio po przeszczepie, przeciwciała przeciw HLA I i ABO,
· Ostre – w ciągu 3 mieś. po przeszczepie, występuje u 75% biorców

przeszczepu.

Objawy kliniczne

: gorączka, pogorszenie stanu ogólnego, bolesność w okolicy

przeszczepu, pogorszenie czynności nerki,

· Przewlekłe – występuje powszechnie, głównie na zasadzie nadwrażliwości typu

późnego.

Objawy kliniczne

: białkomocz, nadciśnienie, postępująca niewydolność nerki

Powikłania internistyczne po przeszczepie nerki

· Sercowo – naczyniowe (najczęstsza przyczyna zgonu),
· zakażenia układu oddechowego,

· posocznica,
· zakażenia układu moczowego,

· zapalenie mózgu i opon mózgowo-rdzeniowych,

· zakażenia wirusowe (CMV, EBV, WZW, HIV, HPV),
· nowotwory.

Przykład kliniczny

1. Dane kliniczne
U chorego leczonego od kilku lat z powodu tocznia układowego wystąpiły obrzęki

kończyn.

W toku rutynowych badań laboratoryjnych stwierdzono białkomocz. Na podstawie

badania histologicznego i immunohistochemicznego biopsji nerki rozpoznano

glomerulonephritis chronica

. W ciągu roku po rozpoznaniu chory był poddawany

hemodializie. Po znalezieniu odpowiedniego dawcy podjęto decyzję o zabiegu

przeszczepienia nerki.

2. Przeprowadzone badania laboratoryjne biorcy i dawcy
· Oznaczenie antygenów grup krwi

Stwierdzono pełną zgodność w zakresie układu ABO

· Typowanie antygenów zgodności tkankowej HLA-A, -B, -DR (

metoda opisana na

str.64

)

Biorca: HLA-A2, -A3; HLA-B8, -B35; HLA-DR3, -DR1

Dawca: HLA-A1, -A3; HLA-B8, -B35; HLA-DR3, -DR1

· Próba krzyżowa (cross-match) (

metoda opisana na str.66

)

W surowicy krwi biorcy nie stwierdzono przeciwciał przeciwlimfocytarnych

3. Monitorowanie po przeszczepie
· Nerka podjęła pracę, w drugim dniu po operacji chory oddał 5 litrów moczu.

Stężenie mocznika i kreatyniny były w normie.

•

W 7 dniu po operacji stężenie kreatyniny w surowicy wzrosło, nastąpiło

podwyższenie ciepłoty ciała. Rozpoznanie ostrego odrzutu potwierdzono badaniem

biopsyjnym przeszczepionej nerki. W części korowej stwierdzono wystąpienie
nacieków limfocytarnych.

www.lek2002.prv.pl

•

Podjęto leczenie polegające na dożylnym podawaniu metyloprednizolonu przez 3

dni. Po 24 godzinach poziom kreatyniny wrócił do normy, zwiększyła się objętość
wydalanego moczu.

•

Podobne epizody powtórzyły się w 5-tym i 7 tygodniu po zabiegu. Postępowanie
było podobne.

•

Do 9 miesiąca po zabiegu stosowano leczenie immunosupresyjne.

Przeszczepy komórek krwiotwórczych

Uwagi wstępne

•

Leczenie na drodze przeszczepienia szpiku jest zagrożone śmiertelnymi

powikłaniami. Powinno być ograniczone tylko do tych chorób, które bez takiego
leczenia są śmiertelne.

•

Ogólny stan kliniczny chorego musi być na tyle dobry, by mógł on przeżyć zabieg
przeszczepienia.

•

Wiek chorego: p. allogeniczny do 55 r. ż.

p. autologiczny do 65 r. ż.

Wskazania dotyczą 3 rodzajów chorób

•

Wrodzone defekty komórek krwiotwórczych

Ciężki złożony niedobór odporności, agammaglobulinemia Brutona, choroba

Wiscota-Aldricha, agranulocytoza Kostmanna, osteoporoza, choroba Gauchera,

niedokrwistość Diamonda-Blackfana.

· Choroby nowotworowe

przewlekła białaczka szpikowa, ostre białaczki, szpiczak mnogi, zespół mielo-

dysplastyczny.

· Choroby autoimmunizacyjne - celem jest wyeliminowanie komórek układu

odpornościowego reagujących na własny antygen organizmu. Podstawowym
wskazaniem jest ciężka niedokrwistość aplastyczna, podejmowane są próby leczenia

tą drogą stwardnienia rozsianego i tocznia rumieniowatego.

Dobór dawca – biorca

Typowanie HLA: wymagana jest zgodność w zakresie antygenów HLA klasy I A i B

(typowanie serologiczne) oraz w zakresie HLA DR (typowanie molekularne, PCR)

Pule dawców

· Rodzeństwo. Kompleks genów HLA dziedziczy się w sposób kodominujący (tj.

ekspresji ulegają geny zarówno chromosomu 6 uzyskanego od matki, jak i geny

uzyskane od ojca). Możliwość powtórzenia się określonej kombinacji wynosi 25%
dla każdego brata lub siostry.

· Rodziny poszerzone (krewni wstępni: rodzice, krewni zstępni: dzieci, ciotki,

wujowie, kuzyni),

· Rejestry honorowych dawców szpiku,

· Banki krwi pępowinowej.

www.lek2002.prv.pl

Składowe zabiegu przeszczepiania komórek krwiotwórczych

Czynności wstępne:
- Ustalenie wskazań

- Decyzja auto/allo

- Źródło komórek krwiotwórczych
Jeżeli szpik – pobranie dawcy ok. 0,5 l krwi na 2 tyg. przed pobraniem szpiku,

przetoczenie po pobraniu szpiku.
Jeżeli krew – podanie dawcy cytokin krwiotwórczych
Zabieg:
- izolacja biorcy w środowisku ubogobakteryjnym (sala laminarna), założenie

central-nego cewnika żylnego,

- mieloablacja (niszczenie dotychczasowego układu krwiotwórczego)

cytostatyki – busulfan, melfalan, pochodne nitrozomocznika, tiotepa lub

napromieńiowanie całego ciała

- immunoablacja (niszczenie dotychczasowego układu immunologicznego)

duże dawki cyklofosfamidu, globuliny antylimfocytarnej, analogów puryn

- pobranie szpiku lub komórek krwiotwórczych krwi od dawcy
- dożylne przetoczenie ich biorcy

- intensywna opieka hematologiczna (4-8 tyg. po przeszczepieniu)

- intensywny nadzór ambulatoryjny (3-6 mieś. po przeszczepieniu)
- prowadzenie biorcy w warunkach nadzoru ambulatoryjnego przez 1,5 roku po

przeszczepieniu, a następnie coroczne kontrole ambulatoryjne chorych bez powikłań

- leczenie przewlekłej choroby GvH (ok. 10% chorych)

- leczenie nawrotu choroby podstawowej (np. białaczki)

Powikłania zabiegu przeszczepiania komórek krwiotwórczych

1. Nawrót choroby podstawowej

2. Skutki megachemio- i radioterapii

3. Zaburzenia wynikające z funkcjonowania samego przeszczepu:

· Opóźnienia w odtwarzaniu krwiotworzenia i odporności

· Odrzucenie przeszczepu
· Choroba przeszczep przeciw gospodarzowi (GvH)

A. GvH dotyczy

· 50% przeszczepów od dawców spokrewnionych, 5-10% zgonów

· 90% przeszczepów od dawców niespokrewnionych, 20-40% zgonów
· częstość występowania i przebieg zależy od wieku chorego.

B. Jest następstwem reakcji przeciw mniejszym antygenom zgodności tkankowej

C. Diagnostyka

· kolonizacja naskórka przez limfocyty i apoptoza keratynocytów
· kolonizacja gruczołów jelitowych i przewodów gruczołowych przez limfocyty,

apoptoza enterocytów

www.lek2002.prv.pl

· kompozycja nacieku: przewaga limfocytów CD8+, domieszka CD4+

i monocytów/makrofagów

· poziom białka C-reaktywnego – odzwierciedla intensywność zapalenia

bakteryjnego lub grzybiczego

· poziom IgE – oddaje proces zaangażowania IL-4 w ustalenie równowagi

poprzeszczepowej między Th1 i Th2.

· wzrost aktywności enzymów wątrobowych i poziomu bilirubiny

D. Postać ostra

· dotyczy skóry, wątroby i przewodu pokarmowego
· występuje w ciągu pierwszych 100 dni po przeszczepieniu

· jest powodowana przez limfocyty dawcy obecne w przeszczepie

E. Postać przewlekła

· występuje po upływie 100 dni po przeszczepie

· jest powodowana przez limfocyty wytworzone u biorcy przez komórki

macierzyste dawcy

· występuje w postaci ograniczonej i uogólnionej (twardzina, zespół Sjogrena,

przykurcze, wyniszczenie, brak odporności)

F. Korzystne skutki reakcji GvH

· przeszczep przeciw białaczce

Inne powikłania

· Choroba zarostowa żył wątrobowych
· Zespół przeciekających włośniczek

Przykład kliniczny

A. Dane kliniczne

22-letni mężczyzna poddawany był chemioterapii z powodu ostrej białaczki

mieloidalnej (AML). Po trzech kursach chemioterapii uzyskano całkowitą remisję. W

ciągu roku po zakończeniu chemioterapii zaistniało podejrzenie nawrotu choroby i
konieczność przeprowadzenia przeszczepienia szpiku kostnego.

B. Przeprowadzone badania laboratoryjne.

- Badania immunofenotypowe krwi i szpiku chorego w celu potwierdzenia

nawrotu AML - met. cytometrii przepływowej (

metoda opisana na str.48

)

- Oznaczenie antygenów grup krwi
- Stwierdzono pełną zgodność w zakresie układu ABO

- Typowanie antygenów zgodności tkankowej HLA-A, -B, -DR
- Ponieważ dawcą szpiku był brat chorego, różnice w zakresie antygenów

zgodności tkankowej między dawcą i biorcą dotyczyły tylko antygenów HLA-B

- Próba krzyżowa (cross-match)
- W surowicy krwi biorcy nie stwierdzono przeciwciał przeciwlimfocytarnych

C. Zarys procedury przeszczepienia

- Pacjentowi podano cyklofosfamid w dawce 120 mg/kilogram masy ciała

- Naświetlanie całego ciała w celu zniszczenia układu odpornościowego.

- Bezpośrednio po naświetlaniu przeprowadzono dożylną transfuzję komórek

szpiku dawcy (brata) w ilości 109 komórek szpikowych/kilogram masy ciała.

- Dla ochrony przed wystąpieniem choroby przeszczep przeciw gospodarzowi

(GvH), choremu podawano metotreksat. Mimo to, po 28 dniach od wykonania

Document Outline