Instrukcja do Warsztatów (Ćwiczenie 3)
Rozdział białek metodą filtracji żelowej
i wyznaczanie ilości białka metodą Lowry’ego
CEL ĆWICZENIA:
Do rozdziału białek różniących się masą cząsteczkową zastosowano filtrację żelową.
W wyniku rozdziału uzyskano dwie frakcje o różnych czasach retencji. Celem ćwiczenia jest
oznaczenie stężenia białka w zebranych frakcjach przy zastosowaniu metody Lowry’ego.
ODCZYNNIKI I APARATURA:
1. Wzorzec białka 20mg% BSA (Bovine Seminal Albumin)
2. 2% Na
2
CO
3
w 0.1 M NaOH
3. 2% CuSO
4
4. 5% C
4
H
4
O
6
KNa • 4 H
2
O (uwodniony winian sodowo-potasowy)
5. 2N odczynnik Folina-Ciocalteu
6. Spektrofotometr do pomiarów w zakresie widzialnym
CZĘŚĆ I
Wykonanie krzywej wzorcowej
1. Przygotowanie odczynnika Lowry’ego do oznaczeń: do 15 ml 2% Na
2
CO
3
w 0.1 M
NaOH dodać 0.3 ml 5% C
4
H
4
O
6
KNa•4H
2
O (uwodnionego winianu sodowo-potasowego).
Dobrze wymieszać a następnie dodać 0.3 ml 2% CuSO
4.
2. Przygotowanie odczynnika Folina-Ciocalteu: 2N roztwór odczynnika Folina-Ciocalteu
rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 2:1 (woda:odczynnik). Potrzebna do
wykonania ćwiczenia końcowa objętość tego odczynnika wynosi 1.5 ml.
3. Zasada oznaczania:
•
•
•
w 9 probówkach przygotować odpowiednią objętość odczynnika Lowry’ego wg tabeli
dodać odpowiednie ilości wzorcowego roztworu 20mg% BSA
dobrze wymieszać i odczekać 10 minut.
Nr
Objętość
odczynnika Lowre’go [
µl]
Objętość
20mg% BSA [
µl]
1.
90 + 1000
10
2.
80 + 1000
20
3.
70 + 1000
30
4.
65 + 1000
35
5.
60 + 1000
40
6.
55 + 1000
45
7.
50 + 1000
50
8.
45 + 1000
55
9. 1100
ŚLEPA PRÓBA
po 10 minutach do każdej probówki dodać po 100
µl przygotowanego wcześniej
odczynnika Folina-Ciocalteu
•
•
•
•
dobrze i energicznie wymieszać, odczekać 15 minut
po tym czasie zmierzyć absorbancję próbek przy długości fali równej
λ=660 nm
względem próby ślepej
wyniki oznaczeń zanotuj w poniższej tabeli:
Nr Absorbancja
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
CZĘŚĆ II
Oznaczenie stężenia białka w zebranych frakcjach
1. Stosując te same procedury co w części I przygotuj cztery probówki i odpowiednie
odczynniki.
2. Wykonaj analizę dla trzech próbek białka o nieznanym stężeniu (pamiętaj o próbce
referencyjnej). Wyniki zanotuj w tabeli:
Nr
Nazwa próbki
Objętość
próbki
[
µl]
Objętość
odczynnika
Lowry’ego [
µl]
Objętość
odczynnika
Folina [
µl]
Absorbancja
1. przed
rozdziałem
2
98 + 1000
100
2. I frakcja
6
94 + 1000
100
3. II frakcja
3
97 + 1000
100
OPRACOWANIE WYNIKÓW I DYSKUSJA:
Na podstawie odczytanych wartości absorbancji dla roztworów BSA 20mg% wykreślić
krzywą wzorcową (zależność stężenia od absorbancji).
Korzystając z otrzymanej krzywej wzorcowej i odczytanych absorbancji dla trzech
badanych próbek (przed rozdziałem, I frakcja, II frakcja) odczytać zawartość białka w
badanej próbce i obliczyć stężenie białka podając je w mg/ml.
LITERATURA:
1. Lowry O. H., N. J. Rosebrough A.L. Farr, Randall R. J. “Protein measurement with the Folin-Phenol
reagents”, J. Biol. Chem., 193 (1951), 265-275
2. Dubin A, Turyna B. „Praktikum z biochemii dla studentów biologii i biotechnologii” IBM UJ 2001
3. Kłyszejko – Stefanowicz L. „Ćwiczenia z biochemii”, PWN 1999
4. L. Stryer „Biochemia”, PWN 1999 i nowsze wydania
5. Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W. „Biochemia Harpera”, Wydawnictwo
Lekarskie PZWL, 2002