Niedokrwistość sierpowatokrwinkowa

NIEDOKRWISTOŚĆ SIERPOWATOKRWINKOWA

Do szpitala zgłosili się rodzice (emigranci z Afryki) z dzieckiem rasy czarnej, 7-letnim

synem (B.R. - Bob). Bezpośrednią przyczyną przyjęcia chłopca do szpitala, był występujący
uporczywy kaszel oraz płytki, przyspieszony oddech. Badającego lekarza zaniepokoiło także
występowanie  bólu  w  klatce  piersiowej  przy  próbie  głębszego  oddechu,  znaczne
powiększenie śledziony oraz bolesny obrzęk grzbietowych powierzchni dłoni i stóp.
Z wywiadu zebranego od rodziców, uzyskano dodatkowe informacje:
Po  raz  pierwszy,  napady  bólu  w  okolicach  bioder  oraz  ud  utrzymujące  się  1-2  dni
występowały u dziecka od 2-go roku życia; kilkakrotnie wystąpiły w ciągu 7-letniego okresu
życia dziecka, ale były one znacznie słabsze.
Pobrano  krew  z  żyły  odłokciowej  chłopca  w  celu  wykonania  badań  dodatkowych
(morfologia,  stężenia  elektrolitów,  glukozy)  oraz  aby  oznaczyć  grupę  krwi.  Po  uzyskaniu
zgody  rodziców,  pobrano  także  krew  w  celu  pozyskania  i  zabezpieczenia  DNA  (do
identyfikacji  ewentualnych  mutacji).  Ze  względu  na  małe  wysycenie,  Hb  tlenem  (90%;
wykonano pomiar przy pomocy pulsoksymetru), zastosowano tlenoterapię.
W badaniach dodatkowych stwierdzono u chłopca (Bob):

Morfologia

Wartości referencyjne

7,8 g%

(12-16 g%)

Hematokryt 23%

(41-53 %)

Erytrocyty 3,2 mln

(3,5-5,7)

Leukocyty 6000

(4000-10 000)

Bilirubina w surowicy 40 µmol/L

(3-22 µmol/L)

(produkt katabolizmu hemu)

W  rozmazie  krwi  obwodowej,  stwierdzono  obecność  erytrocytów  o  zniekształconym
kształcie, przypominającym sierpowaty oraz zwiększoną ilość retikulocytów (20%).
Na  podstawie  obrazu  klinicznego  oraz  wstępnych  wyników  postawiono  rozpoznanie  u
dziecka  niedokrwistości  sierpowatokrwinkowej.  Pomimo  ujemnego  wywiadu  rodzinnego
(rozwój dziecka był prawidłowy), podobny profil badań wykonano u 2-letniej siostry (A.R. -
Alice)  chorego  chłopca  (B.R.  -  Bob).  Wyniki  podstawowych  badań  diagnostycznych  oraz
parametrów morfologii, nie odbiegały od normy.

W laboratorium wyizolowano z erytrocytów B.R. (Bob) i A.R. (Alice) hemoglobinę i

poddano analizie elektroforetycznej  dwoma metodami. Porównano szybkość wędrówki tych
białek  w  polu  elektrycznym  z  szybkością  wędrówki  hemoglobiny  wyizolowanej  z
erytrocytów zdrowego człowieka (o inicjałach H.M.).

Metoda I. Elektroforeza w warunkach „naturalnych”, bez uprzedniej denaturacji

białka. Rozdział przeprowadzono w buforze o pH 8,6 (Rys. 1).

Metoda II. Elektroforeza w warunkach denaturujących białko. Próbki białek, przed

przeprowadzeniem analizy poddano denaturacji przez ogrzewanie w 100

C w 1% roztworze

siarczanu dodecylu sodu (SDS) i redukcji 1% roztworem merkaptoetanolu (redukuje mostki
disiarczkowe). Elektroforezę przeprowadzono w buforze o pH 8,3 (Rys. 2).

Ponieważ w laboratorium pracowali w tym czasie studenci, polecono im przeprowadzić dwa
proste doświadczenia, zanotować ich przebieg i poczynione obserwacje.

Doświadczenie I. Do heparynizowanej probówki pobrano kilka mililitrów krwi Boba

i odstawiono probówkę do statywu. Po 1 min delikatnie pobrano pipetą zawiesinę erytrocytów
z  górnej  (a),  dolnej  (b)  warstwy  zawiesiny  komórek,  oraz  po  wstrząśnięciu  zawartości
probówki (c). Pod mikroskopem oceniano kształt erytrocytów w wykonanych rozmazach.
Zaobserwowano,  że  po  czasie  około  1  min  krwinki  na  dnie  próbówki  przyjęły  kształt
„sierpowaty”, natomiast krwinki w górnej części probówki zachowały normalny wygląd. Po
wstrząśnięciu  zawartości  probówki  prawie  wszystkie  krwinki  powróciły  do  normalnego
kształtu.

Doświadczenie II. Do czterech kolejnych probówek wlano po 4 ml roztworu: (1) 500

mM sacharozy; (2) 300 mM NaCl; (3) 100 mM NaCl; (4) soli fizjologicznej. Następnie do
każdej z probówek wprowadzono po 1 ml krwi pobranej od Boba. Określono czas, w którym
na dnie każdej z probówek rozpoczynała się „sierpowata” deformacja krwinek:

(1) 500 mM sacharoza

4 min 18 sek

(2) 300 mM NaCl

2 min 11 sek

(3) 100 mM NaCl

21 min 24 sek

(4) sól fizjologiczna

7 min 35 sek

PYTANIA.

1.  Czym różni się HbS od HbA ?
2.  Co było przyczyną dolegliwości bólowych chłopca?
3.  Dlaczego, po przyjęciu  do szpitala podano mu  tlen? Czy można przewidywać, że to

poprawi jego stan?

4. Wyniki badań biochemicznych krwi Boba znacznie odbiegają od wartości

prawidłowych. Co może być tego przyczyną?

5. Co jest przyczyną zmiany kształtu krwinek zawierających HbS? Jakie czynniki

sprzyjają tej zmianie?

6. Który z zastosowanych systemów elektroforezy może być pomocny w ocenie ryzyka

wystąpienia objawów anemii sierpowatej u siostry chłopca, Alice? Porównaj obrazy
analizy preparatów hemoglobiny w obu systemach i przeprowadź ich interpretację.

7. Czym różni się, w doświadczeniu I, otoczenie krwinek na dnie, od otoczenia krwinek

w górnej części probówki? W jaki sposób wytrząsanie zmieniło to otoczenie? Który z
czynników otoczenia krwinek powoduje ich „sierpowatość”?

8. Oblicz osmolarność każdego z czterech badanych w doświadczeniu II roztworów.
9. Czy na podstawie doświadczenia II można wnioskować o zależności pomiędzy

stężeniem hemoglobiny (HbS) w krwinkach a ich skłonnością do „sierpowatości”?

ZATRUCIE INHIBITOREM ACETYLOCHOLINESTERAZY

Do SOR (Szpitalny Oddział Ratunkowy) Kliniki Toksykologicznej przywieziono 50-

letniego  Jana  K.  Główne  dolegliwości  zgłaszane  przez  chorego  to:  zaburzenia  widzenia,
niepokój, kaszel oraz uczucie duszności. Lekarz stwierdził u chorego znaczne łzawienie gałek
ocznych,  zwężenie  źrenic,  znaczną  potliwość  skóry  oraz  osłabienie  i  drżenie  mięśni.  Nie
stwierdzono u niego zaburzeń świadomości, oraz mowy.
W wywiadzie uzyskano dodatkowe informacje od chorego:
Jan  K.  był  rolnikiem,  i  w  godzinach  rannych  tego  dnia  wykonywał  w  ogrodzie,  opylanie
roślin roztworem pestycydu. Nie przestrzegał jednakże czasu ekspozycji na insektycyd, oraz
nie używał maski. Dolegliwości, które zgłaszał pojawiły się kilka godzin później.
Z  powodu  trudności  oddechowych,  chorego  przyjęto  do  OIT  (Oddział  Intensywnej  terapii).
Rozpoczęto monitorowanie czynności serca i oddychania oraz wdrożono leczenie atropiną.

Z opisu środka owadobójczego, który używał Jan K. wynikało, że w jego skład

wchodził malation (Rys. 1), związek fosforoorganiczny, którego mechanizm działania na
centra katalityczne pewnej grupy enzymów jest podobny do mechanizmu działania
diizopropylofluorofosforanu (DFP) (Rys. 2), znanego inhibitora proteinaz serynowych.

Wyniki badań biochemicznych krwi Jana K. nie odbiegały od wartości prawidłowych.

Jedynie aktywność acetylocholinesterazy w krwinkach czerwonych była o 30 % niższa, niż u
ludzi zdrowych. Aktywność acetylocholinesterazy krwinek Jana K. porównywano z
aktywnością handlowego preparatu acetylocholinesterazy, którego parametry K

(0,14 M) i

max

(10 mol min

-1

g

-1

), wobec acetylocholiny jako substratu, wyznaczyli pracujący w

laboratorium studenci. Studentom polecono ponadto określić wartości tych parametrów w
sytuacji, gdy w mieszaninach reakcyjnych, poza substratem, znajduje się
diizopropylofluorofosforan (DFP) w stężeniu 10 M.

Acetylocholina jest neurotransmiterem, który przenosi sygnał z komórek nerwowych

do  np.  komórek  mięśniowych.  Po  odebraniu  sygnału  przez  odpowiedni  receptor,
neurotransmiter  powinien  ulec  zniszczeniu,  co  w  przypadku  acetylocholiny,  polega  na
hydrolizie  cząsteczki  sygnalnej.  Reakcję  hydrolizy  acetylocholiny  katalizuje  enzym,
acetylocholinesteraza:

ACETYLOCHOLINA + H

 OCTAN + CHOLINA

Enzym związany jest z błonami komórek tkanek, które ulegają pobudzeniu (np.

synapsy pomiędzy komórkami nerwowymi a mięśniowymi) i jego aktywność jest ściśle

związana z przekazywaniem impulsu nerwowego. Acetylocholinesteraza znajduje się również
w krwinkach czerwonych.

Centrum katalityczne acetylocholinesterazy ukryte jest w głębokiej kieszeni w

cząsteczce białka, a zasadniczą rolę w reakcji hydrolizy acetylocholiny pełnią znajdujące się
w centrum katalitycznym łańcuchy boczne trzech aminokwasów: seryny, histydyny i
glutaminianu – podobnie jak w przypadku „triady katalitycznej” trypsyny lub chymotrypsyny.

Acetylocholinesteraza jest obiektem ataków trucizn jadu węży i zsyntetyzowanych

przez  człowieka  toksycznych  związków  fosfoorganicznych,  które  były  używane  jako  gazy
bojowe  (tabun,  sarin,  soman).  Związki  z  tej  grupy,  są  także  stosowane  jako  środki
owadobójcze.

Postępowanie terapeutyczne w zatruciach związkami fosforoorganicznymi jest

uwarunkowane  od  stopnia  ekspozycji  na  związek  oraz  objawów  klinicznych.    Podczas
leczenia  (które  powinno  być  prowadzone  w  OIT  -  monitorowanie  czynności  serca  i
oddychania)  podawana  jest  atropina,  która  blokuje  pozazwojowe  receptory  cholinergiczne
(znosi  działanie  acetylocholiny).  Reaktywatory  acetylocholinesterazy  (oksymy  -  np.
obidoksym)  są  stosowane,  jeżeli  zespół  cholinergiczny  jest  wywołany  związkami
fosforoorganicznymi,  pestycydami  lub  gazami  bojowymi.  Mechanizm  działania  tej  grupy
leków  polega  na  reakcji  ze  zmodyfikowanym  przez  truciznę  centrum  katalitycznym
acetylocholinesterazy,  co  odtwarza  funkcjonalny  łańcuch  boczny  odpowiedniego
aminokwasu.

Związki fosfoorganiczne, inhibitory acetylocholinesterazy, stosowane są również jako

leki (np. łagodzące objawy miastenii lub choroby Alzheimera) w celu wzmocnienia sygnału
acetylocholiny.

Odmiennie działają, stosowane jako leki, odwracalne inhibitory acetylocholinesterazy,

np.  E2020  czyli  Aricept.  Te  związki  blokują  bardzo  specyficznie  i  w  odwracalny  sposób
centrum  katalityczne  enzymu.  Struktury  związków  tej  grupy  zostały  zaprojektowane  na
podstawie znajomości trójwymiarowej struktury centrum katalitycznego enzymu (Rys. 3).

Rys. 3. Kompleks
acetylocholinesterazy z E2020
(Aricept). PDB: 1EVE

PYTANIA.
1. Do jakiej klasy enzymów należy acetylocholinesteraza? Jaką reakcję katalizuje i jaka jest

znaczenie tej reakcji?

2. Acetylocholinesteraza jest enzymem o bardzo wysokiej „liczbie obrotów”. Wyjaśnij to

pojęcie. Jak wyznacza się wartość „liczby obrotów”?

3. Dlaczego cząsteczka sygnałowa powinna, po przekazaniu sygnału, zostać usunięta? Czy

może mieć to związek z wartością K

cat

acetylocholinesterazy?

4. Atropina jest antagonistą receptora muskarynowego acetylocholiny. Co to oznacza? Jaki

jest spodziewany wpływ atropiny na przewodnictwo w synapsach cholinergicznych? Na
czym polega działanie terapeutyczne atropiny w przypadku zatrucia inhibitorami esterazy
acetylocholinowej?

5. Jaką rolę pełnią w centrum aktywnym reszty Ser, His i Glu?
6. Dlaczego związki fosfororganiczne są silnie toksyczne? Do jakiej klasy inhibitorów je

zaliczamy? Jaki jest mechanizm ich działania?

7. Czy obecność DFP w przeprowadzonym doświadczeniu studenckim wpłynie na mierzone
wartości K

i V

max

acetylocholinesterazy? Zaproponuj plan eksperymentu pozwalającego

określić wpływ inhibitora na wartości Km i Vmax.
8. Czy obecność atropiny w mieszaninie reakcyjnej doświadczenia studentów może wpłynąć
na mierzone wartości K

i V

max

acetylocholinesterazy?

9. DFP i malation hamują esterazę acetylocholinową tworząc wiązanie kowalencyjne z
kluczową dla katalizy resztą seryny. Czy istnieje zatem możliwość reaktywacji enzymu?
10.

Pod adresem Protein Data Bank (

http://www.rcsb.org/pdb

) znajdź stronę Molecule of

the Month: Acetylcholinesterase oraz struktury przedstawione na Rys. 3.