Microsoft Word - 3Pdst biotechnologii

PODSTAWY BIOTECHNOLOGII

Piotr Solarczyk

EFEKT KOŃCOWY
Po zakończeniu seminarium powinieneś umieć:
wyjaśnić pojęcia plazmid, fag, wektor, wektor ekspresyjny i czółenkowy, klonowanie,

transfekcja, transformacja, insert, episom,

  wymienić i scharakteryzować poznane wektory,
  scharakteryzować enzymy restrykcyjne,
  omówić budowę sztucznych chromosomów bakteryjnych i drożdżowych,
  scharakteryzować metody bezpośredniego wprowadzania DNA do komórek.

Biotechnologia jest interdyscyplinarną dziedziną nauki, która obejmuje wiele kierunków

technicznego  wykorzystania  materiałów  i  procesów  biologicznych.  Europejska  Federacja
Biotechnologii (EFB) opisuje tę dziedzinę jako „integrację nauk przyrodniczych i inżynieryj-
nych w celu osiągnięcia zastosowań organizmów, komórek lub ich części oraz molekularnych
analogów dla pozyskania produktów lub usług”. Współczesna biotechnologia ma zastosowa-
nie  głównie  w  przemyśle  spożywczym,  chemicznym,  farmaceutycznym,  medycynie,  rolnic-
twie  i  w  ochronie  środowiska.  Przedstawienie  podstaw  biotechnologii  jest  niezwykle  trudne
ze względu na złożoność zagadnień i szybki rozwój technik biologii molekularnej. Poniższy
przegląd dotyczy jedynie wybranych aspektów laboratoryjnej pracy z DNA.

Pierwszym etapem pracy z materiałem genetycznym jest izolacja DNA, która polega na

oddzieleniu DNA od innych struktur komórkowych oraz od cząsteczek RNA i białek (histo-
nów). DNA można uzyskać z prawie każdego materiału biologicznego (np. z krwi, nasienia,
plwociny, kału, bakterii). Do niedawna w celu izolacji DNA wykorzystywano metodę z uży-
ciem fenolu i chloroformu, a obecnie coraz częściej korzysta się z komercyjnych zestawów.
Każda procedura izolacji DNA powinna zakończyć się oceną jego ilości i jakości. Wyizolo-
wany DNA można przechowywać w temperaturze +4°C lub - 20°C. Wyizolowany, totalny
kwas nukleinowy powinien być albo hydrolizowany odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi
albo powinien być bezpośrednio namnożony za pomocą PCR. Dalszym procesem, w zależ-
ności od założeń, jest klonowanie w wektorach i transformacja komórek gospodarza. Badanie
powinno zakończyć się analizą i/lub ekspresją odpowiednich genów/fragmentów DNA w ko-
mórkach docelowych.

Enzymy restrykcyjne

Enzymy restrykcyjne (endonukleazy restrykcyjne, restryktazy) to są enzymy bakteryjne

rozpoznające i hydrolizujące DNA w określonych miejscach. Restryktazy są zaangażowane
w obronę komórki bakteryjnej przed wirusami. Znanych jest kilka klas restryktaz. Największe
znaczenie mają enzymy II klasy. Dotychczas wyizolowono kilkaset enzymów restrykcyjnych,
których nazwy pochodzą od gatunku bakterii, np. Eco RI wyizolowano z Escherichia coli ze
szczepu RY 13, a Sau3A z Staphylococcus aureus. Oprócz restryktaz, istnieje szereg innych
enzymów wykorzystywanych w inżynierii genetycznej. Należą do nich:
-

ligazy pozwalające na łączenie fragmentów DNA,

egzonukleazy umożliwiające odpowiednią "obróbkę" końców w modyfikowanych frag-

mentach DNA,

polimerazy, które są odpowiedzialne za powielanie (amplifikację) odpowiednich odcinków

DNA (PCR - reakcja łańcuchowej polimerazy).

Sekwencje restrykcyjne to krótkie, palindromowe fragmenty

DNA rozpoznawane przez

enzymy restrykcyjne.

Endonukleazy rozpoznają z reguły sekwencje o długości 4 do 8 pz,

a produkty ich trawienia mają zakończenia w postaci jednoniciowego ogona na końcu 3` lub
5` („lepkie” końce). „Lepkie” końce umożliwiają łączenie fragmentów DNA pochodzących
z różnych źródeł. Zatem jest to stosunkowo prosty sposób na wbudowanie fragmentów DNA
do plazmidów lub DNA innych wektorów.

Ogólna charakterystyka plazmidów i bakteriofagów

Plazmid to pozachromosomowa, z reguły kolista cząsteczka DNA zdolna do samodzielnej

replikacji, która występuje u prokariota i niektórych organizmów eukariotycznych. Plazmidy
pełnią w komórkach funkcje pomocniczych chromosomów i są przenoszone w trakcie proce-
su  koniugacji  między  komórkami  bakteryjnymi.  Jednym  z  najlepiej  poznanych  plazmidów
jest plazmid F z E. coli. Jest to plazmid typu koniugacyjnego, ponieważ jest transferowany
z komórki donora do akceptora. Szczepy bakterii zawierają różną liczbę plazmidów. Plaz-
midy  ulegają  replikacji  niezależnie  od  macierzystego  genomu  bakterii,  także  w  komór-
kach  gospodarzy należących  do  innych  gatunków.  Chociaż  plazmidy  nie  są  one  konieczne
do  życia  bakterii,  to  jednak  mogą:  (1)  powodować  oporność  na  antybiotyki  i  jony  metali
ciężkich, (2) umożliwiać katabolizm toksycznych związków (toluen), (3) wpływać na choro-
botwórczość  bakterii  oraz  na  zdolność  do  syntezy  związków  oddziaływujących  na  rozwój
innych  bakterii,  (4)  umożliwiać  interakcje  z  roślinami  (wiązanie  azotu)  oraz  koniugację
bakterii. Plazmidy można wyizolować niezależnie od chromosomu bakteryjnego.

W pracach molekularnych, w których wykorzystuje się E. coli, stosuje się także wiele bak-

teriofagów (wirusy infekujące bakterie). Bakteriofagi pasożytują w organizmach prokario-
tycznych, dlatego wykazują znaczne podobieństwo do swoich gospodarzy. Bakteriofagi mają
różne kształty - ikosaedralne

, pałeczkowate, helikalne lub są w postaci główki z ogonem.

W ich budowie wyróżnia się jedno- lub dwuniciowy DNA lub RNA, otoczony białkiem kap-
sydu

. Namnażanie fagów jest szybkie, wskutek czego na jedną komórkę bakteryjną przypa-

dają setki cząsteczek faga. W przyrodzie występuje wiele różnych typów fagów, które infeku-
ją tylko określone gatunki bakterii. Ekspresja genomu faga wymaga zawsze enzymów komór-
kowych  bakterii,  ponieważ  wirus  nie  jest  zdolny  do  samodzielnego  powielenia  się.  Jednym
z najlepiej poznanych fagów jest fag λ, którego można używać jako wektora do klonowania.
Fag λ, o wielkości 48 kpz, naturalnie infekuje bakterie E. coli wstrzykując dwuniciowy, linio-
wy DNA do komórki, w której przekształca się w formę kolistą. To przekształcenie umożli-
wiają  sekwencje  cos  znajdujące  się  na  końcach liniowego  DNA  faga.  DNA  faga  albo  ulega
replikacji i tworzy potomne cząsteczki wirusa uwalniane na drodze lizy komórki bakteryj-
nej  (droga  lityczna)  albo  ulega  integracji  z  genomem  gospodarza  i  pozostaje  w  nim  przez
długi czas (droga lizogeniczna). W cyklu litycznym ekspresji ulegają wszystkie geny wirusa,
podczas gdy ekspresja i replikacja genów gospodarza jest zahamowana. Z zarażonej komórki
uwalnia  się  ok.  100  potomnych  cząstek  wirusowych  (wirionów).  Natomiast  zintegrowana
forma  wirusa  (zwana  profagiem),  pozostaje  w  komórce  gospodarza  przez  wiele  pokoleń.
Przerwanie szlaku lizogenicznego może nastąpić dopiero wtedy, gdy zainfekowana komórka
zostanie narażona na bodźce chemiczne lub fizyczne (np. promieniowanie); ekspresja genów
faga zachodzi w różnym czasie po infekcji; najpierw następuje ekspresja genów, tzw. natych-
miastowych,  a  następnie  opóźnionych.  W  końcu  powstają  białka  strukturalne  niezbędne  do
złożenia nowych cząstek wirusa i lizy komórki.

Sekwencja palindromowa - sekwencja zasad w jednej nici DNA jest identyczna jak odczytywana wspak

sekwencja nici komplementarnej.

Wirusy o symetrii ikosaedralnej – kapsyd tych wirusów ma bardzo uporządkowaną strukturę, składa się

z dwudziestu trójkątnych ścian i dwunastu rogów, czyli wierzchołków.

kapsyd – zbudowana z wielu podjednostek (kapsomerów) otoczka białkowa chroniąca DNA wirusa.

Wektory

Wektor to cząsteczka DNA (wirus, plazmid, kosmid, lub sztuczny chromosom), która służy

do wprowadzenia obcego materiału genetycznego do innego  gospodarza. Wektor, w którym
umieszcza  się  stosunkowo  krótki  fragment  DNA,  zawierający  badany  gen  lub  sekwencję,
nazywany  jest  rekombinowanym  DNA.  Wektory  stosuje  się  do  klonowania  i  amplifikacji
sekwencji  DNA,  badania  mechanizmów  ekspresji  DNA,  wprowadzania  genów  do  komórek
zwierzęcych (transfekcja) i bakteryjnych (transformacja). Każdy wektor nie powinien zakłó-
cać funkcji życiowych komórek gospodarza. Natomiast powinien posiadać zdolność do nieza-
leżnej  replikacji  razem  z  wbudowanym  fragmentem  DNA.  Wektor  powinien  być  też  łatwo
wykrywalny w komórce za pomocą genów markerowych.

Jednym z ważniejszych problemów w biotechnologii jest pojemność wektora, która decy-

duje o wielkości wprowadzanego DNA (wielkości klonowanego insertu). Plazmidy, które są
najczęściej stosowane jako wektory, mają najmniejszą pojemność; w przypadku klonowania
dłuższych insertów stosowane są bakteriofagi, kosmidy, sztuczne chromosomy bakteryjne
(BAC) E. coli lub sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC) Saccharomyces cerevisiae
(Tabela 1).

Tabela 1. Pojemność wybranych wektorów.

Wektor

Wielkość insertu

wektor ekspresyjny

ok. 8 kpz

plazmid (E. coli)

ok. 15 kpz

fag λ

ok. 25 kpz

kosmid

ok. 45 kpz

BAC

ok. 500 kpz

YAC

ok. 1000 kpz

W biotechnologii stosowane są także wektory plazmidowe dla drożdży, tzw. episomalne

wektory  drożdżowe  (YEps),  które  służą  do  klonowania  i  ekspresji  genów  w  komórkach
drożdży  S.  cerevisiae.  YEps  są  zbudowane  na  bazie  plazmidu  2µ  naturalnie  występującego
u drożdży. Wektory episomalne, mimo że replikują jak plazmidy, mogą albo włączać się do
chromosomu drożdży albo pozostać pozachromosomowo.

Odmienne nośniki przystosowano do włączenia obcego DNA do genomu roślinnego, po-

nieważ praca z materiałem roślinnym wymaga zastosowania nieco innej strategii. Najczęściej
wykorzystywany  jest  bakteryjny  plazmid  Ti  z  bakterii  Agrobacterium  tumefaciens,  która
naturalnie  infekuje  rośliny  dwuliścienne  (pomidor,  tytoń,  groch)  oraz  rośliny  jednoliścienne
(ryż). Podczas naturalnej infekcji, część plazmidu Ti zwana T-DNA, włączana jest do chro-
mosomowego  DNA  roślinnego,  co  powoduje  niekontrolowany  wzrost  komórek  roślinnych
(guzowatość szyjki korzenia, czyli zrakowacenie).

Wektory do wprowadzania DNA do innych komórek eukariotycznych, np. utrzymywanych

w hodowlach tkankowych, są konstruowane w oparciu o wirusy, które naturalnie infekują
dany gatunek gospodarza. DNA wektora utrzymywany jest w komórce pozachromosomowo
albo też w formie zintegrowanej z genomem gospodarza (SV40, bakulowirusy, retrowirusy,
adenowirusy).

Wektory plazmidowe

Wektory oparte na plazmidach są stosowane jako narzędzia do poznawania genomów

komórek roślin i zwierząt. Wektor plazmidowy musi zawierać region początku replikacji
(ori), który pozwala na niezależne namnażanie się w komórkach. Należy jednak podkreślić,
że proces niezależnego namnażania wektora zachodzi z udziałem polimerazy i innych skład-
ników cytofizjologii komórki gospodarza. Drugim ważnym miejscem w wektorze plazmido-
wym jest wielokrotne miejsce klonowania (wiele miejsc rozpoznawanych przez różne enzy-

my restrykcyjne, MCS). Jest to miejsce, do którego wprowadza się badany fragment DNA,
czyli insert. Wektor plazmidowy musi posiadać promotor.

Niektóre wektory plazmidowe wymagają sekwencji wiążącej rybosom (RBS) i kodonu

inicjacji translacji, a inne - sekwencji umożliwiającej łatwiejsze oczyszczenie na drodze
chromatografii (metka HisTag). Wektory, które służą do ekspresji klonowanych fragmentów
DNA w komórkach, nazywamy plazmidowymi wektorami ekspresyjnymi.

Wektory bakteriofagowe (fagi)

Wektory bakteriofagowe pozwalają na wklonowanie większego insertu niż wektory

plazmidowe;  np.  do  cząsteczki  faga  λ  można  wprowadzać  insert  o  wielkości  25  kpz.  Na
podstawie  faga  λ  opracowano  szereg  innych  wektorów,  zwanych  wektorami  wymiennymi
(np. EMBL3 lub λDASH).

Jako wektory w pracach z E. coli używa się także fagi pałeczkowate, np. M13. Cząsteczki

tego wirusa zawierają kolisty, jednoniciowy DNA. Po wniknięciu faga M13 do komórki bak-
teryjnej syntetyzowana jest komplementarna nić i fagowy DNA powiela się już jako dwuni-
ciowy kolisty DNA; ta forma replikacyjna (RF) występuje w około 100 kopiach na komór-
kę. W przeciwieństwie do faga λ, fag M13 nie powoduje lizy komórek bakteryjnych, a tyl-
ko  spowalnia  ich  wzrost.  Ponadto,  oprócz  formy  RF,  jednocześnie  powstają  opakowywane
kapsydem  cząsteczki jednoniciowego  DNA,  które  są  uwalniane  z  komórek  w  kolejnych  po-
działach  bakterii.  Użyteczną  cechą  wektora  M13  jest  to,  że  formę  RF  można  oczyszczać
i  stosować  tak  jak  plazmid,  a  jednocześnie  można  izolować  DNA  wektora  z  pożywki  w
formie jednoniciowej.

Wiele wektorów plazmidowych opracowano jako hybrydowe połączenia z fagiem M13,

np. wektor pBluescript, który zawiera zarówno fagowe i plazmidowe miejsce początku
replikacji, lecz nie posiada genów potrzebnych do pełnego cyklu życiowego faga. Wektory
hybrydowe łączą zalety łatwej obróbki i szybkiego wzrostu.

Kosmidy

Kosmidy są sztucznie stworzonymi wektorami, powstałymi z połączenia plazmidu i se-

kwencji  cos  faga  λ  (sekwencja  odpowiedzialna  za  cyrkulizację  DNA).  Kosmidy  z  wprowa-
dzonym insertem są pakowane w kapsydy i są wykorzystywane do zakażenia komórek bakte-
ryjnych.  W  przeciwieństwie  do  faga  λ,  kosmidy  nie  niszczą  zainfekowanych  komórek. Naj-
prostszym wektorem kosmidowym jest typowy plazmid z miejscem ori i markerem selekcyj-
nym, zawierającym dodatkowo sekwencję cos i odpowiednie miejsce restrykcyjne do klono-
wania.  Po  trawieniu  (cięciu)  wektora  odpowiednim  enzymem  restrykcyjnym  i  zligowaniu

z docelowym insertem, kosmid pakowany jest do cząsteczek fagowych. Po wprowadzeniu
większego insertu do kosmidu wydłuża się czas jego replikacji oraz zmniejsza się liczba jego
kopii. Kosmidy umożliwiają klonowanie długich fragmentów DNA (ok. 45 kpz).

Sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC)

Wektor YAC jest wektorem bifunkcjonalnym, ponieważ jest zdolny do powielania w ko-

mórkach  bakterii  i  drożdży.  S.  cerevisiae  to  organizm  dobrze  scharakteryzowany  metodami
fizjologicznymi i biochemicznymi, który jest hodowany w warunkach in vitro na dużą skalę,
m.in. dla potrzeb przetwórstwa żywności, ponieważ nie wytwarza toksyn, a hodowle nie ule-
gają zakażeniom wirusowym. Sekwencje „drożdżowe” centromeru (CEN 4), telomeru (TEL)
i miejsca początku replikacji (ARS) zostały wyizolowane i połączone z plazmidami skonstru-
owanymi  dla  E.  coli.  Sekwencja  TEL  stanowi  część  DNA,  która  w  komórkach  drożdży
wydłużana jest przez enzym telomerazę. Sekwencja CEN 4 funkcjonuje prawidłowo podczas

ligacja DNA – łączenie się odcinków DNA poprzez wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych za pomocą enzymu

ligazy DNA.

segregacji chromosomów S. cerevisiae w procesie mitozy. Sekwencja ARS pełni rolę miejsca
początku replikacji, podobnie jak sekwencja ori u bakterii. Chociaż w wektorach YAC można
klonować bardzo długie odcinki DNA, często okazuje się, że klonowane inserty zawierają
nieciągłe sekwencje, przez co są niestabilne.

Sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC)

Wektory BAC skonstruowano, aby uniknąć problemów związanych ze stosowaniem wek-

torów YAC. Do wektorów BAC można wprowadzić insert o długości około 100-500 kpz.
W porównaniu do wektorów YAC, wektory BAC są bardziej stabilne, łatwiej się nimi trans-
formuje komórki E. coli oraz łatwiej je namnażać i izolować z komórek bakteryjnych. Wekto-
ry BAC zbudowane są na bazie plazmida F; zawierają geny istotne dla replikacji i utrzymy-
wania się w komórce bakterii E. coli. Wektory BAC są obecnie używane w projektach mapo-
wania genów.

Wektory eukariotyczne oparte na wirusach

Transfekcja jest procesem, który polega na wprowadzeniu obcego DNA do komórek

eukariotycznych. Rekombinowanie organizmów wyższych stwarza więcej problemów niż
transformacja bakterii. Komórki, do których może wniknąć obcy DNA w warunkach in vitro,
nazwane są komórkami kompetentnymi. Wiele wektorów stosowanych do transfekcji ko-
mórek eukariotycznych skonstruowano jako wektory czółenkowe, zwane również wektora-
mi wahadłowymi, ponieważ zawierają sekwencje potrzebne do replikacji i selekcji w E. coli
oraz w komórkach eukariotycznych.

Dzięki technikom biologii molekularnej możliwe jest usuwanie z genomu wirusów genów

związanych z ich cyklem rozwojowym i wstawianie w ich miejsce genu terapeutycznego. Tak
zmodyfikowany wirus nie ulega namnażaniu w komórce gospodarza, ale pozostawia w niej
wprowadzony insert.

Retrowirusy

potrafią zakażać wiele rodzajów komórek, lecz ulegają stabilnej integracji

z DNA gospodarza, co nie zawsze jest korzystne. Adenowirusy mogą wnikać do nie dzielą-
cych się komórek, ale wywołują niepotrzebną reakcję odpornościową gospodarza. Chociaż
niektóre wirusy AAV, często towarzyszące adenowirusom, nie wywołują odpowiedzi układu
odpornościowego, to jednak w warunkach laboratoryjnych trudno uzyskać je w dużej liczbie.

Wektory skonstruowane w oparciu o genom herpetowirusów (wirus opryszczki, HSV)

mogą  infekować  także  nie  dzielące  się  komórki  i  przenosić  duże  fragmenty  obcego  DNA.
Wirus  HSV,  pomimo  chorobotwórczości,  jest  jednym  z  najważniejszych  kandydatów  do
wykorzystania jako wektor.

Bakulowirusy infekują komórki owadów i powodują nadekspresję białka - poliedryny,

która gromadzi się w zakażonych komórkach. Ta cecha bakulowirusów wykorzystywana jest
do nadekspresji obcych genów, dzięki czemu można produkować duże ilości białka w hodow-
li zainfekowanych komórek owadów. Metoda ta jest coraz częściej stosowana do produkcji
białek pochodzenia zwierzęcego na dużą skalę.

Do wprowadzania genów do komórek ssaków wykorzystywane są wirusy ssaków. Jed-

nym z pierwszych użytych do tego celu był wirus SV40 infekujący wiele gatunków ssaków.
Natomiast, retrowirusy, których genomy zbudowane są z RNA, planuje się do użycia w tera-
pii genowej, ponieważ obcy DNA może być za ich pośrednictwem włączony do genomu gos-
podarza w stabilny sposób. Dodatkową zaletą retrowirusów jest niska immunogenność, nato-
miast  ich  wadą  jest  wywołanie  mutacji  w  DNA  gospodarza.  Najczęściej  wykorzystywanym
wektorem retrowirusowym jest wirus białaczki mysiej Moloneya (MoMuLV). Istotnym ogra-
niczeniem jest fakt, że do retrowirusów nie można wbudować insertu większego niż 1 kpz.

Retrowirusy – posiadają genom RNA oraz kodują odwrotną transkryptazę; niektóre mają budowę ikosaedralną

(np. HIV).

Inne metody wprowadzania DNA do komórki

Niektóre obecnie stosowane wektory nie są precyzyjne w swoim działaniu, inne niezbyt

wydajnie  przenoszą  DNA,  a  jeszcze  inne  pobudzają  niepożądaną  odpowiedź  układu  odpor-
nościowego  gospodarza.  Stąd  prowadzone  są  intensywne  badania  nad  syntetycznymi  nośni-
kami DNA. Liposomy to zamknięte pęcherzyki lipidowe, w których umieszcza się zrekombi-
nowany DNA; zapewnia to ochronę przed nukleazami (enzymy hydrolizujące kwasy nuklei-
nowe).  Liposomy  mogą  być  użyte  do  przenoszenia  DNA  przez  błonę  komórkową.  Niestety
wydajność  tej  metody  jest  niska.  Natomiast  zaletą  tej  metody  jest  fakt  braku  odpowiedzi
immunologicznej  w  komórkach  zwierzęcych.  Jednakże  jest  to  metoda  pracochłonna  i  duże
fragmenty DNA nie zawsze udaje się właściwie zapakować do liposomów bez uszkodzeń.

Obcy DNA może być także wprowadzany do komórek eukariotycznych bez użycia wekto-

ra, czyli na drodze bezpośredniego przenoszenia genów. Istnieje kilka metod bezpośrednie-
go transferu fragmentu obcego DNA do komórki docelowej.

Elektroporacja to proces zachodzący w błonie komórkowej pod wpływem wyładowań

pól elektrycznych (milisekundy), który powoduje odwracalne zmiany w błonie komórkowej.
W przypadku komórek drożdży i roślin, ściana komórkowa musi być wcześniej strawiona za
pomocą enzymów; dopiero wtedy powstaje delikatny protoplast zdolny do przyjęcia obcego
DNA. Protoplast jest wystawiony na działanie krótkich impulsów elektrycznych rzędu mikro-
i milisekund o wysokim napięciu. Następnie protoplast przenoszony jest do pożywki w celu
odtworzenia ściany komórkowej i namnożenia.

Mikrowstrzeliwanie polega na wprowadzeniu DNA opłaszczonego na mikroskopijnych

kulkach złota lub wolframu za pomocą urządzenia zwanego „armatką genową”.

Mikroiniekcja stosowana jest do wprowadzania obcego DNA do komórek zwierząt;

w tym celu trzeba wyizolować zygotę lub wczesny embrion i przy pomocy szklanej mikropi-
pety wprowadzić obcy DNA do jądra komórki. W celu dalszego rozwoju ztransformowaną
komórkę umieszcza się w zastępczej matce. Zaletą tej metody jest wysoka wydajność, lecz
wadą - pracochłonność.

Biotechnologia jest jedną z najszybciej rozwijających się dziedzin nauki. Niesie za sobą

korzyści i niebezpieczeństwa. Zatem należy pamiętać, aby zawsze stawiać pytanie jak daleko
można się posunąć aby nie naruszyć delikatnej równowagi stworzonej przez naturę.

Zalecane piśmiennictwo i strony internetowe:

Turner P. C., McLennan A. G., Bates A. D., White M. R. H.,(przekład zbiorowy pod

redakcją Zofii Szweykowskiej-Kulińskiej), Biologia molekularna, Wydawnictwo
Naukowe PWN, Warszawa, 2004.